Immunofunctionalization of magnetic poly(glycidyl methacrylate) microspheres and investigation of their effectiveness in animal cell purification
Manyetik poli(glisidil metakrilat) mikrokürelerin immünofonksiyonalizasyonu ve hayvansal hücre saflaştırılmasındaki etkinliğinin araştırılması
- Tez No: 216767
- Danışmanlar: PROF. DR. ADİL DENİZLİ, PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2008
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Bölümü
- Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 104
Özet
Bu çalışmada, Fe(II) ve Fe(III) tuzlarının ikili çöktürülmesiyle elde edilen demir oksit nanoparçacıkları varlığında eş boy dağılımlı manyetik poli(glisidil metakrilat) (m-PGMA) mikroküreler dispersiyon polimerizasyonu yöntemiyle sentezlenmişlerdir. Manyetik olmayan poli(glisidil metakrilat) (PGMA) mikroküreleri ise aynı prosedür ve aynı reçete ile, fakat demir oksit nanoparçacıkları yokluğunda sentezlenmişlerdir. Daha sonra bu küreler aminlenmiş ve glutaraldehit aktivasyonu gerçekleştirilmiştir. Demir oksit nanoparçacıkların ortalama büyüklüğü DLS ile 57 nm olarak ölçülmüştür. SEM ile PGMA mikrokürelerin büyüklüğü 2.4 ? m, m-PGMA mikrokürelerinin büyüklüğü 2.1 ? m olarak ölçülmüştür ve dar bir boy dağılımı gözlenmiştir. VSM sonuçları demir oksit nanoparçacıkların ve m-PGMA mikrokürelerin süperparamanyetik olduğunu göstermiştir ve doygunluk manyetizasyonları sırasıyla 74.37 ve 1.33 emu/g olarak ölçülmüştür. Glutaraldehit aktivasyonu sonrasında protein A, PGMA (GA-PGMA) ve m-PGMA (GA-m-PGMA) mikrokürelere kesikli sistemde kovalent olarak immobilize edilmiştir İmmobilizasyon koşulları sırasıyla şöyledir: pH: 9.5 (borik asit tamponu), sıcaklık: 25°C, karıştırma hızı: 250 rpm ve immobilizasyon süresi: 3 saat. Protein A başlangıç konsantrasyonu 0.1?0.8 mg.mL-1 aralığında değiştirilmiş ve maksimum bağlanmanın elde edildiği protein A konsantrasyonu 0.4 mg.mL-1 olarak belirlenmiştir. Maksimum immobilizasyon kapasiteleri sırasıyla GA-PGMA ve GA-m-PGMA için 2.65 mg/g polimer ve 3.12 mg/g polimer olarak bulunmuştur. Aktive edilmemiş mikroküreler için ise 0.4 mg.mL-1 protein A konsantrasyonunda sırasıyla 0.66 mg/g polimer and 1.67 mg/g polimer'dir. Hücre kültürü çalışmaları sonucunda, başlangıçtaki hücrelerin sayıca toplam %61'inin m-PGMA ve %84'ünün ise m-PGMA-PrA mikrokürelere bağlandıkları gözlemlenmiştir. Sonuçta bu çalışma bize, m-PGMA-PrA mikroküreler kullanılarak manyetik kuvvet ile T ve B lenfositlerin birbirlerinden ayrılmasında başarılı olacağını gösteren bir model oluşturmuştur.
Özet (Çeviri)
In this study, monodisperse magnetic poly(glycidyl methacrylate) (m-PGMA) microspheres were synthesized by dispersion polymerization in the presence of iron oxide nanoparticles obtained by precipitation of Fe(II) and Fe(III) salts. Nonmagnetic poly(glycidyl methacrylate) (PGMA) microspheres were synthesized by using the same procedure and the same recipe but in the absence of iron oxide nanoparticles. Epoxy groups onto the microspheres were reacted with aqueous ammonia solution to provide amino groups and then microspheres were activated with glutaraldehyde. The mean size of iron oxide nanoparticles were determined as 57 nm by DLS. SEM results showed that PGMA microspheres had an average size of 2.4 µm and m-PGMA microspheres had an average size of 2.1 µm. VSM results showed that iron oxide nanoparticles and m-PGMA microspheres were superparamagnetic, and saturation magnetizations were 74.37 and 1.33 emu/g, respectively. Bioligand protein A was then covalently immobilized onto these glutaraldehyde activated microspheres. Immobilization conditions are as follows: pH: 9.5 (boric acid buffer), temperature: 25°C, stirring rate: 250 rpm and immobilization time: 3 h. The initial protein A concentration was changed in the range of 0.1?0.8 mg.mL-1. The amount of immobilized protein A was determined by fluorescence spectrophotometer (Cary Eclipse, Varian Inc., AU) (?exc.=227 nm, ?em.=304.8 nm) by using a calibration curve. The maximum immobilization amount of protein A onto the microspheres was shown at a concentration of 0.4 mg.mL-1. Maximum immobilization capacities were found to be 2.65 mg/g polymer for GA-PGMA and 3.12 mg/g polymer for GA-m-PGMA. Protein A immobilization capacities for plain PGMA and m-PGMA were 0.66 mg/g polymer and 1.67 mg/g polymer at a protein concentration of 0.4 mg.mL-1. Cell culture studies denoted that 61% of total cells and 84% of total cells were bound to the m-PGMA and m-PGMA-PrA microspheres, respectively. Thus, this study represents a good model for fractionation of T? and B?lymphocytes by using protein A immobilized magnetic poly(glycidyl methacrylate) microspheres in further studies.