Geobacillus sp. 71 endoksilanaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve enzimin karakterizasyonu
Cloning, expression and characterisation of endoxylanase from Geobacillus sp. 71
- Tez No: 276133
- Danışmanlar: DOÇ. DR. SABRİYE ÇANAKÇI
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2010
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Karadeniz Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 82
Özet
Ksilan, doğada ikinci sırada sıklıkta bulunan bir polisakkarittir. Endoksilanazlar da ksilanın hidrolizinden sorumlu bir enzim grubu olup başta kağıt ve kağıt hamuru endüstrileri olmak üzere endüstride en çok kullanılan enzimlerden biridir. Termofilik mikroorganizmaların ksilanazları sıcaklık ve pH değişikliklerine karşı dirençli olduklarından dolayı endüstiyel süreçlerde önemli rolleri vardır.Bu çalışma da Geobacillus sp. 71 izolatı olarak isimlendirilen termofilik bir bakterinin ısıl kararlı ksilanaz gen sırasının invers PCR yöntemi ile bulunması, bir E. coli ekspresyon vektörüne klonlanması, saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Geobacillus sp. 71 endoksilanazı kodlayan 1224 nt`lik genin baz dizilimi belirlenerek pET20b+ vektörüne klonlandı. Geni içeren vektör, E.coli BL21 hücresine aktarılarak ksilanaz ekspres edildi ve MagneHisTM Protein Saflaştırma Sistem kiti kullanılarak enzim saflaştırıldı. Saflaştırılan Geo71 Endoksilanaz enziminin optimum çalışma sıcaklığının 75 ºC ve optimum pH'nın ise 7,0 olduğu bulundu. Oat spelt xylan için olan Km değerinin 0,425 mM olduğu ve bu değerin diğer ksilanaz enzimlerine göre daha düşük olduğu belirlendi. Vmaks değeri 500 U/mg olarak belirlendi. Metal iyonlarının ve çeşitli kimyasalların enzime olan etkileri değişik konsantrasyonlarda gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda belirlendi ve 10 mM konsantrasyonda Hg2+ bivalent metal iyonunun enzim aktivitesini neredeyse tamamen inhibe ettiği tespit edildi. Enzimin molekül ağırlığı 47 kDa olup amino asit benzerliğine göre family 10 glikosil hidrolaz sınıfı bir enzim olduğu belirlendi. Geo71 endoksilanaz enziminin oat spelt xylan substratını hidrolizlemesi sonucu ortaya çıkan şekerlerin başlıca ksilobioz, ksilotetroz olduğu ayrıca bunların yanında az miktarda da olsa ksilotrioz ve diğer bazı oligosakkaritlerinde oluştuğu ince tabaka kromotografisinde (TLC) ile ortaya çıkarıldı.Elde edilen veriler ışığında, enzimin biyokimyasal özellikleri, enzimin önemli bir endüstriyel enzim olabileceğini göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Xylan is the second most abundant polisaccaride in nature. Endoxylanases, responsible for hydrolysis of the xylan, are an enzyme group used commonly in industry which is used especially at paper and pulp industries. In specially, xylanases from thermophiles are expected to play a significant role in industrial processes, since they are thermostable and resistant to pH changes.In this study determining the thermal stable xylanase gene sequence of a thermophilic bacterium which is called Geobacillus sp. 71 by inverse PCR, cloning of this gene to an E. coli expression vector, its purification and characterization are realized. A 1224 bp endoxylanese gene coding from Geobacillus sp. 71 sequenced and cloned into pET20b+ vector. Vector encoding this gene was transformed into E.coli BL21, expressed and enzyme was purufied by MagneHisTM Protein Purification System and characterized. The Geo71 Endoxylanase enzyme showed optimal activity at 75 °C in pH 7,0. It was determined that the enzyme had a lower Km 0,425 mM for oat spelt xylan than most of the xylanases and Vmax of value 500 U/mg. Effects of metal ions and some chemicals on the enzyme was determined by the studies that were conducted with different concentrations. Hg2+ (10 mM) almost strongly inhibited the enzyme activity. On the basis of amino acid sequence similarities, this 47 kDa enzyme could be assigned to family 10 of the glycosyl hydrolase classification system. Purified enzyme catalyzed the hydrolysis of oat spelt, the level of xylobiose and xylotetraose was high along with xylotriose and some oligosaccharides analyzed on TLC.In the light of all data it has been suggested that the enzyme?s biocatalytic properties proved to be one of the important industrial enzymes.
Benzer Tezler
- Geobacıllus sp. tarafından termostabil ?-amilaz üretimi
Thermostable ?-amylase production by Geobacillus sp.
SENNUR ÇALIŞKAN
- Termofilik Geobacillus sp. TF17 suşundan esteraz saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of esterase from a thermophilic bacterium, Geobacillus sp. TF17
ÇİĞDEM AYNA
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET ÇOLAK
- Termofilik Geobacillus sp. TF14'ten endüstriyel öneme sahip α-amilazın saflaştırılması, immobilizasyonu ve karakterizasyonu
Purification, immobilisation and characterization of indutrially important α-amylase from a thermophilic bacteria Geobacillus sp. TF14
ŞABAN KESKİN
Doktora
Türkçe
2015
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NAGİHAN SAĞLAM ERTUNGA
- Termofilik Geobacillus sp. TF16 suşundan fitaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve doğal bir besin kaynağındaki fitatı parçalama etkinliğinin incelenmesi
Purification and characterization of phytase from Geobacillus sp. TF16 and investigation hydrolysis of soymilk phytate
EMRE DOKUZPARMAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NAGİHAN SAĞLAM ERTUNGA
- Termofilik Geobacillus sp. DF20 suşundan esterazın saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of esterase from a thermophilic bacterium, Geobacillus sp. DF20
ESRA ÖZBEK
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET ÇOLAK