Geri Dön

JAK2V617F mutasyonunun altın nanoflares kullanılarak tespiti

Detection of JAK2V617F mutation using gold nanoflares

PDF İndir

  1. Tez No: 370115
  2. Yazar: ERHAN APTULLAHOĞLU
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. SELÇUK SÖZER TOKDEMİR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Hematoloji, Biotechnology, Genetics, Hematology
  6. Anahtar Kelimeler: Miyeloproliferatif Neoplazi (MPN), Janus Kinaz 2(JAK2), Mutasyon, Nanopartikül, Nanoflare, Myeloroliferative Neoplasm(MPN), Janus Kinase 2(JAK2), Mutation, Nanoparticles
  7. Yıl: 2014
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 92

Özet

ÖZET Aptullahoğlu, E. JAK2V617F Mutasyonunun Altın Nanoflares Kullanılarak Tespiti. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Genetik ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul. 2014 Amaç. Miyeloproliferatif Neoplaziler (MPN) oldukça sık görülen ve ölümle sonuçlanan hastalıklardır. JAK2V617F mutasyonu, yaklaşık olarak PV'lerin % 95 inde, ET ve PMF'lerin % 60'ında saptanmıştır. Bu sebeple mutasyonun tespiti, hastalıkların tanısı için temel kriterdir. Ayrıca JAK2V617F ekspresyon seviyesindeki değişimlerin tespit edilebilmesi hastalığın seyri ve tedaviye yanıt açısından önemlidir. Gen ekspresyon analizinde kullanılan geleneksel yöntemler lize veya fikse hücreler üzerinden gerçekleştirilmesi yönünden sınırlı bir teknolojiye sahiptir. RNA'ları direkt olarak canlı hücrede ve tek hücre bazında tespit edebileceğimiz bir yöntem mevcut araştırmalara üstünlük sağlayacaktır. Bu amaç doğrultusunda, yakın zamanda geliştirilen“altın nanoflares”teknolojisini kullanarak JAK2V617F mutasyonunun canlı hücrelerde tespitini hedeflemekteyiz. Bu çalışmadaki hipotez;“MPN'lerde oldukça sık görülen JAK2V617F mutasyonu, canlı hücrelerde mutasyon tespitini mümkün hale getiren bir yöntemle tespit edilebilirse, geleneksel yöntemlere göre bazı avantajlar sağlar.”Bu hipotezi ispatlamak için JAK2V617F mutasyonuna özel altın nanoflares, hücre soylarında ve hasta mononükleer hücrelerinde kullanılarak etkinliğinin ölçülmesi amaçlandı. Yöntem. Altın nanoflares problarının hücreler üzerindeki etkilerini anlamak amacıyla JAK2V617F mutasyonunu homozigot formda taşıyan HEL ve heterozigot formda taşıyan SET-2 hücre soyları ile JAK2V617F mutasyonunu taşımadığı bilinen K562 hücre soyu kullanıldı. Bu ön çalışmadan sonra Polisitemia Vera (PV) hastalığı tanısı konmuş 4 gönüllüden alınan periferik kan mononükleer hücreleri fikol gradient yöntemiyle toplandı. Hücre soyları ve hasta mononükleer hücrelerinde iki aşamalı allel spesifik PZR yöntemiyle JAK2V617F mutasyonuna bakıldı. Hasta mononükleer hücrelerinde mutant ve/veya yabani tipte olduğu altın nanoflares probları kullanılarak tespit edilen hücre populasyonları hücre ayırıcı ile ayrılarak RNA izolasyonu yapıldı. RNA'dan cDNA sentezlendi ve qRT-PZR yöntemiyle LightCycler 480 cihazı kullanılarak JAK2V617F ekspresyon analizi yapıldı. Bulgular. HEL hücre soyunun JAK2V617F mutant allelleri homozigot formda taşıdığı, K562 hücre soyunun ise JAK2V617F bakımından yabani tipte olduğu altın nanoflares deneyleriyle gösterilmiştir. SET-2 hücre soyunda yapılan deneylerde ise sonuç alınamamış, altın nanoflares problarının hücre içine alınamadığı düşünülmüştür. 4 PV hastasına ait periferik kan mononükleer hücrelerinde JAK2V617F mutasyonuna spesifik problar aracılığı ile hücre ayrımı yapılmış, mutant ve yabani tip hücre grupları arasındaki ekspresyon farkı gerçek zamanlı kantitatif RT-PZR ile desteklenmiştir. İki aşamalı allel spesifik PZR'de hasta-1, hasta-2 ve hasta-4'ün JAK2V617F mutasyonu bakımından tamamen mutant olduğu, hasta-3'ün ise mutant ve yabani tip allelleri birlikte taşıdığı görülmüştür. Sonuç. Literatürde ilk kez bir mutasyonun altın nanoflares ile tespiti yapılmıştır. Canlı hücrelerde JAK2V617F mutasyonunun tespiti için altın nanoflares problarının kullanılabileceği gösterilmiştir. Yöntemin mevcut yöntemler kadar hassas olma potansiyeli vardır. Çünkü analiz için kullanılan akım ölçer cihazı tek hücre bazında tespit yapabilmekte ve mutasyon taşıyan hücreyi seçme imkanı sağlamaktadır. Kullandığımız yöntem diğer birçok yönteme göre daha az iş yükü ve daha düşük maliyet gerektirmesi yönüyle de mevcut yöntemlere avantaj sağlayabilir. Sonuç olarak bu çalışma tanı veya fonksiyonel amaçlı kullanılan tekniklere avantaj sağlamaktadır.

Özet (Çeviri)

ABSTRACT Aptullahoğlu, E., Detection of JAK2V617F Mutation Using Gold Nanoflares. Istanbul University. Institute of Health Sciences. Department of Genetics. MSc. Thesis. Istanbul. 2014. Objective: Myeloproliferative Neoplasms (MPN) are frequently encountered fatal diseases which are 95% of PV and 60% of ET and PMF patients carry JAK2V617F mutation. For this reason, the detection of JAK2V617F is a major criterian for diagnosis of the malignancies and detection of changes in expression levels of JAK2V617F is an important for prognosis as well as response to the treatment. Until now the conventional methods that were used in gene expression analysis have limited technologies due to their starting material which are fixed or lysed cells. The method that can directly detect RNA in living and also a single cell will be superior to the existing methods. The detected cell population with mutation can be used in other experimental procedures because use of their viability. Therefore, the detection of JAK2V617F mutation by gold nanoflares technology is applied in this study. The hypothesis of this study is to develope a new method to detect JAK2V617F mutation in live cells that provides advantages over traditional methods. To prove this hypothesis, JAK2V617F mutant and JAK2 wild-type specific gold nanoflares will be employed on cell lines as well as patients' mononuclear cells. Method: JAK2V617F homozygous (HEL) and heterozygous (SET-2) cell lines were applied to understand effects of gold nanoflares on cells. JAK2 wild-type cell line K562 was used as control cells. After preliminary study, we collected peripheral blood mononuclear cells of four volunteered Polycythemia Vera (PV) patients by ficoll gradient method. Peripheral blood mononuclear cells from patients and cell lines were examined for the JAK2V617F mutation with nested allel spesific PCR method. Mutant and/or wild-type cell populations were determined with the gold nanoflares application and then sorted by fluorescence activated cell sorter (FACS). Total RNA was extracted from these sorted cell populations. cDNA was synthesized from the RNA and further studied for the expression of JAK2V617F with qRT-PCR method with LightCycler-480 device. Findings: The homozygous JAK2V617F mutant gene expression in HEL cells and wild type JAK2 gene expression in K562 cells could be detected with gold nanoflares. Experiments performed with the SET-2 cells yielded no results because of their cellular uptake were very low. Mutant and/or wild-type cell populations in peripheral blood mononuclear cells from four PV patients were determined with JAK2V617F spesific gold nanoflares and then sorted by fluorescence activated cell sorter (FACS). Expression differences between mutant and wild-type cell populations were supported by real-time quantitative PCR. The homozygous JAK2V617F mutation in patient 1, 2 and 4 and heterozygous JAK2V617F mutation in patient 3 was determined by allel specific PCR method. Result: Gold nanoflares have been used to detect a mutation for the first time in the literature. Detection of the JAK2V617F mutation by using gold nanoflares in live cells was demonstrated. This method as sensitive as other methods because of the flow cytometry and FACS devices that have been used for analysis, that allows to identify a single cell basis. This method requires less labor and lower cost than other methods after optimization of conditions. As a result, this study will facilitate the techniques used for diagnosis or functional analysis of a mutation.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    487224

    Esansiyel trombositoz hastalarında jak2v617f mutasyonunun klinik ve laboratuvar parametreleri ile ilişkisi

    Clinical and clinical evaluation of jak2v617f mutation in essential thrombocytosis patients relationship with laboratory parameters

    AYLİN KOYUNCUOĞLU

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    HematolojiSağlık Bilimleri Üniversitesi

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TAYYİBE SALER

  2. Tez No

    460230

    Philadelphia kromozomu negatif kronik myeloproliferatif hastalıklarda JAK2 mutasyonu ile serum HDL ve LDL kolesterol düzeyleri arasındaki ilişki

    Relationship between JAK2 mutation and serum HDL and LDL cholesterol levels in chronic myeloproliferative diseases with negative philadelphia chromosome

    YAĞMUR BAŞHAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    HematolojiSağlık Bilimleri Üniversitesi

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    UZMAN HAYRİ POLAT

  3. Tez No

    440341

    Kronik miyeloproliferatif hastalık tanılı hastalarda calr tip 1 ve calr tip 2 gen mutasyonu durumunun saptanması ve klinik ile ilişkisi

    Calr TYPE 1 and calr type 2 gene mutations determination and clinical relationship with chronic myeloproliferative disorders

    MİRAY YAMAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    HematolojiEge Üniversitesi

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜRAY SAYDAM

  4. Tez No

    316737

    Esansiyel trombositemi ve primer miyelofibroz olgularında TET2 mutasyonu

    TET2 Mutations in essential trombocytemia and primary myelofibrosis cases

    CAN TURAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    Hematolojiİstanbul Bilim Üniversitesi

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. REYHAN DİZ KÜÇÜKKAYA

  5. Tez No

    464307

    JAK2V617F mutasyonunun endotel hücreleri üzerindeki trombotik etkilerinin değerlendirilmesi

    Evaluation of thrombotic effects of JAK2V617F mutation on endothelial cells

    HİLAL HEKİMOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Üniversitesi

    Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. SELÇUK SÖZER TOKDEMİR

Geri Dön