Leishmania infantum aşı adayı LACK ve KMP-11 genlerinin moleküler karakterizasyonu, füzyon proteinin ekspresyonu ve antijenik yapısı
Molecular characterization of leishmania infantum LACK and KMP-11 vaccine candidate genes, expression and antigenic structure of fusion protein
- Tez No: 507059
- Danışmanlar: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Parazitoloji, Parasitology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Erciyes Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 148
Özet
Leishmania cinsi zorunlu hücre içi protozoonların neden olduğu leishmaniasis, Dünya Sağlık Örgütü'nün önemli tropikal hastalıklar listesinde yer almaktadır. Leishmaniasis tedavisinde rutin olarak kullanılan bileşiklerin yüksek maliyetleri, toksisite ve yan etkilerinin fazla olması nedeniyle alternatif tedavi ve aşı araştırmaları devam etmektedir. Faz aşamaları devam etmekle birlikte leishmaniasise karşı insanlarda etkili bir aşı henüz geliştirilememiştir. Leishmania infantum, Türkiye'de ve dünyada leishmaniasis formlarından en tehlikelisi olan visseral leishmaniasis (VL) etkenleri arasındadır. Leishmania infantum homolog aktive edilmiş C kinaz reseptörü (LACK) ve Kinetoplastid membran proteini-11 (KMP-11) genleri üçüncü nesil aşılar olarak kabul edilen DNA aşı adayları arasındadır. Bu çalışmada L. infantum'un neden olduğu VL'e karşı aşı geliştirme çalışmalarında umut verici adaylardan olan L. infantum LACK ve KMP-11 genlerinin klonlanması, moleküler karakterizasyonu, insanlarda DNA aşısı olarak kullanıma uygun özellikte bir plazmide multi-antijenik olarak yerleştirilmesi, LACK ve KMP-11 proteinlerinden oluşan füzyon proteininin ekspresyonu ve antijenik yapısının analizi amaçlanmıştır. Çalışmada öncelikle L. infantum promastigot kültüründen genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Sonra LACK geni pJET1.2 plazmidine, KMP-11 geni ise pcDNA 3.1 plazmidine klonlama reaksiyonu ile yerleştirilmiştir. Takiben LACK geni restriksiyon enzimleri ile pcDNA3.1+KMP-11 plazmidine eklenmiş ve multi-antijenik rekombinant DNA elde edilmiştir. Rekombinant plazmid varlığı tüm basamaklarda PCR tarama ile araştırılmıştır. Pozitif kolonilerden plazmid izolasyonu yapılmış ve klonlanan genlerin varlığı PCR ve DNA dizi analiz yöntemleri ile doğrulanmıştır. LACK+KMP-11 genleri ekspresyon vektörüne sub-klonlanarak elde edilen plazmidler kompetan E. coli BL21 hücrelerine transforme edilmiş ve füzyon proteininin ekspresyonu sağlanmıştır. 47 kDa büyüklüğündeki füzyon proteininin varlığı SDS-PAGE ve western blot analizleri ile doğrulanmıştır. Kültüre edilen L. infantum nesillerinin LACK ve KMP-11 gen bölgelerine göre nükleotid ve aminoasit tabanlı moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Leishmania izolatlarının LACK ve KMP-11 gen bölgesi sekans analizleri, bu gen bölgelerindeki intraspesifik nükleotid farklılıklarının interspesifik nükleotid farklılıklarla çakıştığını ve dolayısıyla filogenetik bazda tür ayrımına olanak vermediğini ortaya koymuştur. LACK proteininde 13, KMP-11 proteininde ise 3 antijenik bölgenin mevcut olduğu tespit edilmiş ve proteinlerin 3 boyutlu yapıları elde edilmiştir. Sonuç olarak bu çalışma ile L. infantum kaynaklı VL'e karşı umut verici DNA aşı adaylarından olan LACK ve KMP-11 genlerinin moleküler karakterizasyonu ve filogenetik analizleri yapılmıştır. Bu iki geni birlikte taşıyan multi-antijenik plazmid ve LACK+KMP-11 füzyon proteini ilk kez elde edilmiş ve antijenik yapıları incelenmiştir.
Özet (Çeviri)
Leishmaniasis is caused by an obligate intracellular protozoa Leishmania genus and listed in the major tropical diseases by World Health Organization. Because of the high costs, toxicity and adverse effects of the compounds which are routinely used in the treatment of leishmaniasis, alternative treatment and vaccine studies are currently underway. As well as the phase studies are ongoing an effective vaccine has not been developed yet. Visceral leishmaniasis (VL) is the most dangerous form of leishmaniasis and Leishmania infantum is one of VL agents in Turkey and in the world. Leishmania infantum homolog activated C kinase receptor (LACK) and Kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11) genes are among the DNA vaccine candidates considered as third generation vaccines. This study aims to clone L. infantum LACK and KMP-11 genes, analyze their molecular and phylogenetic characteristics and ligate them into plasmid can be used as multi-antigenic DNA vaccine candidate in human. Additionally, to express fusion protein and analyze its antigenic structure. In the study, primarily genomic DNA isolated from L. infantum promastigote culture. Then, LACK and KMP-11 genes were cloned into pJET1.2 and pcDNA 3.1 plasmids respectively. Subsequently, LACK gene sub-cloned into pcDNA3.1+KMP-11 recombinant plasmid by restriction cloning and multi-antigenic recombinant DNA was obtained. The presence of the recombinant plasmid was investigated by PCR scanning at all steps. Plasmid isolation was performed from positive colonies and the presence of cloned genes was confirmed by PCR and DNA sequencing methods. For expression of the LACK+KMP-11 fusion protein, genes were sub-cloned into pET100 expression vector and plasmids were transformed into competent E. coli BL21 cells. The presence of 47 kDa fusion protein was confirmed by SDS-PAGE and western blot analysis. Nucleotide and amino acid-based molecular characterization of L. infantum genera was performed according to LACK and KMP-11 gene regions. Sequence analysis of LACK and KMP-11 regions of Leishmania isolates revealed that intraspecific nucleotide differences in these gene regions coincided with interspecific nucleotide differences. Thus, these genes did not allow species discrimination on phylogenetic basis. 13 and 3 antigenic regions were determined in LACK and KMP-11 proteins respectively. 3-dimensional structures of the LACK and KMP-11 proteins was obtained. As a result, molecular characterization and phylogenetic analysis L. infantum LACK and KMP-11 genes were performed and LACK + KMP-11 based multi-antigenic plasmid and fusion protein were obtained for the first time with this study.
Benzer Tezler
- Aşı geliştirilmesinde kullanılmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilen L. infantum antijenlerinin in vivo oluşturduğu immün yanıtın karşılaştırmalı olarak incelenmesi
Comparative investigation of in vivo immune response induced by various L. infantum antigens, obtained that are with different techniques, for vaccine development
ÖZLEM AYŞE ÖZYILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MELAHAT BAĞIROVA
- Leishmania infantum DNA aşısı adayı LACK geninin klonlanması
Cloning DNA vaccine candidate LACK gene of leishmania infantum
SERKAN KARACA
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
ParazitolojiErciyes ÜniversitesiParazitoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SALİH KUK
- DNA aşısı adayı leishmania infantum KMP-11 geninin klonlanması
Cloning DNA vaccine candidate KMP-11 gene of leishmania infantum
ŞİRİN SAHRA CEYLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
ParazitolojiErciyes ÜniversitesiParazitoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SALİH KUK
- Leıshmanıa ınfantum'un farklı antijen kombinasyonlarını içeren poli(laktik-ko-glikolik asit) nanopartiküllerinin sentezi, karakterizasyonu ve visseral leishmaniasis'e karşı aşı adayı olarak etkinliklerinin in vitro ve in vivo incelenmesi
Synthesis, characterization and in vitro and in vivo investigation of effectiveness as vaccine candidate against visceral leishmaniasis of poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles containing combination of different antigens of leishmania infantum
ÖZLEM AYŞE TOSYALI
Doktora
Türkçe
2018
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MELAHAT BAGIROVA
- Yeni nesil dizileme teknolojisi ile Türkiye'den izole edilen kutanöz leishmaniosis etkeni leishmania infantum'un genom dizisinin çıkarılması
The genome sequencing with next generation sequencing technology of leishmania infantum causing cutaneous leishmaniosis from Turkish isolate
DİLEK GÜLDEMİR
Doktora
Türkçe
2019
MikrobiyolojiAnkara ÜniversitesiParazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞE SERPİL NALBANTOĞLU