Tetrahymena thermophila'da rekombinant ilaç üretim verimliliğini düşürebilecek bir proteaz geninin gen silme yöntemiyle genomdan silinmesi ve karakterizasyonu
Elimination and characterization of a Tetrahymena thermophila protease gene that can reduce recombinant drug production efficiency by gene knock-out method
- Tez No: 713415
- Danışmanlar: PROF. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biyoloji, Biotechnology, Biology
- Anahtar Kelimeler: Moleküler biyoloji, Peptid hidrolazlar, Rekombinant protein üretimi, Sistein, Molecular biology, Peptide hydrolases, Recombinant protein production, Cysteine
- Yıl: 2022
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Eskişehir Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu tez çalışması ile T. thermophila'nın doğal olarak salgıladığı proteazların dış ortama salgılanan protein yapılı rekombinant biyofarmosötikleri parçaladığı ve üretim verimliliğini düşürdüğü hipotezi test edilmiştir. Literatür araştırması ve biyoinformatik yaklaşımlarla belirlenen sekretom proteaz genlerinden yüksek ekspresyona sahip CTH34 geni somatik homolog rekombinasyon, CYP6, CTH40, CTH90 ve CTH115 genleri ise co-Delesyon yöntemleriyle makroçekirdek genomundan silinmiş, doğal hücre ırkı ile mutant hücre sekretomlarının proteolitik aktivitesi kazein ve rituksimab substratlarına karşı in vitro olarak ölçülmüş ve SDS-PAGE ile substrat degredasyonu tanımlanmıştır. CTH34'ün KO edildiği ırkta sekretomal proteolitik aktivite %34,3 oranında düşerken büyüme eğrisinin logaritmik ve durağan faz hücre sayısında ~%50 oranında azalma bulunmuştur. CYP6-KO ırkında ise rituksimab substratının parçalanmasında belirgin bir düşüş SDS-PAGE'de gözlemlenirken büyüme eğrisinin durağan faz hücre sayısında ~%25 civarında azalma görülmüştür. T. thermophila'nın verimli bir şekilde rekombinant protein ilaç üretimine CTH34 ve CYP6 genleri gibi proteaz genlerinin genomdan silinmesiyle uygun hale getirilebileceği sonucuna varılmıştır.
Özet (Çeviri)
In this thesis, the hypothesis that naturally secreted proteases of T. thermophila degrede protein-structured recombinant biopharmaceuticals secreted externally, and that reduce production efficiency has been tested. Five of highly expressed secretome protease genes were determined via literature research and bioinformatics approaches, and CTH34 gene was deleted by somatic homologous recombination while CYP6, CTH40, CTH90 and CTH115 were deleted by co-deletion, followed by mutant strain confirmation using PCR after antibiotic selection. The proteolytic activity of wild type and mutant culture secretomes was measured in vitro assays against casein and rituximab substrates, and substrate degradation was confirmed by SDS-PAGE. While secretomal proteolytic activity decreased by 34.3% in the CTH34-KO strain, cell number of the flask population in the logarithmic and stationary phase of the growth curve also decreased by ~50%. Besides, it is observed that degradation of the rituximab substrate was significantly reduced by CYP6-KO strain secretome compared to wild type whereas the cell number in the stationary phase of the growth curve also diminished by ~25%. According to forementioned findings, it was concluded that T. thermophila can be efficiently tailored for recombinant protein drug production by deletion of protease genes such as CTH34 and CYP6 from the genome.
Benzer Tezler
- Tetrahymena thermophila glutatyon-S-transferaz zeta geninin klonlanması, biyoinformatik ve deneysel karakterizyonu
Cloning, experimental and bioinformatic characterization of glutathion S-transferase zeta (GST-Z) gene in Tetrahymena thermophila
CEM ÖZİÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
2008
BiyoteknolojiAnadolu ÜniversitesiBiyoteknoloji Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
- Tetrahymena thermophila MAPK enzim ailesinden birinin cdna'sının klonlanması ve mRNA ifadesinin karakterizasyonu
Cloning and characterization of mRNA expression profile of one of the MAPK family enzymes from tetrahymena thermophila
MEHMET TAHA YILDIZ
Doktora
Türkçe
2009
BiyolojiAnadolu ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
- Tetrahymena thermophila katalaz geninin mRNA ifadesinin polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle çeşitli stresler altında kısmi karakterizasyonu
Partial characterization of Tetrahymena thermophila catalase gene mRNA expression under different stress conditions with polymerase chain reaction
OZAN KILIÇKAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2009
BiyoteknolojiAnadolu Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
- Nanomateryallerin Tetrahymena thermophila üzerine toksikolojik etkilerinin ekotoksikolojik yöntemlerle saptanması
Assessing the effect of nanomaterials on Tetrahymena thermophila by ecotoxicological methods
SEDA BERNA BAYKAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2009
BiyolojiMarmara ÜniversitesiÇevre Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ENİS MORKOÇ
- Tetrahymena thermophila ligaz enzim ailesi üyelerinden birinin moleküler ve biyoteknolojik karakterizasyonu
Molecular and biotechnological characterization one of Tetrahymena thermophila DNA ligase enzyme family gene
NURÇİN KÜÇÜKOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyoteknolojiAnadolu Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
- Bioinformatics analysis and gene expression profile of one of the topoisomerase enzymes in Tettrahymena thermophila
Tetrahymena thermophila `da bulunan topoizomeraz enzimlerinden birinin biyoinformatik analizi ve gen ekspresyon profili
HÜSNA KARABOĞA
Yüksek Lisans
İngilizce
2012
BiyolojiFatih ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. SEVİM IŞIK
ÖĞR. GÖR. MEHMET TAHA YILDIZ