Geri Dön

Niallia circulans bakterisinin selülaz aktivitesinin incelenmesi

Investigation of cellulase activity of Niallia circulans bacteria

PDF İndir

  1. Tez No: 999610
  2. Yazar: YAZGAN UĞUR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ESRA SUNGUR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Yazma eserler, bir toplumun kültürel ve bilimsel birikimini yansıtan en önemli kâğıt esaslı kültürel miras öğeleri arasında yer almaktadır. Ancak kâğıdın yüksek selüloz içeriği ve üretiminde kullanılan dolgu maddeleri, bu eserleri biyolojik bozunmaya karşı hassas hâle getirmektedir. Kağıt esaslı kültürel miras üzerinde etkili olan başlıca biyolojik bozunma etkenleri arasında selülaz üreten bakteri türleri bulunmaktadır. Bakterilerin yazma eserlerde neden olduğu bakteriyel bozunmanın tespit edilebilmesi, bununla birlikte kağıtta oluşturduğu fiziksel-kimyasal değişimlerin detaylı olarak incelenmesi önem arz etmektedir. Yazma eserden izole edilen Niallia circulans bakterisi yüksek selülolitik aktiviteye sahip, gram-pozitif, spor oluşturan ve hareketli bir bakteri türüdür. Daha önceki çalışmalarda, bu bakteri sıklıkla izole edilmiş olmakla birlikte, kâğıt üzerine bozunma etkisini uzun süreli ve çok yönlü olarak ele alan bir çalışma yoktur. Bu tez çalışmasında öncelikle N. circulans'ın fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerinin tanımlanması, endoglukanaz enziminin optimum üretimini destekleyen besiyerinin tespit edilmesi, optimum sıcaklık ve pH koşullarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Belirlenen bu optimum koşullarda, endoglukanaz aktivitesi karboksimetil selüloz (CMC), ekzoglukanaz aktivitesi mikrokristalin selüloz (MCC) ve toplam selülaz aktivitesi Whatman No.1 filtre kâğıdı kullanılarak DNS yöntemiyle U/mL birimi kullanılarak kantitatif olarak analiz edilmiştir. Çalışmanın devamında, optimum koşullarda elde edilen ham enzim ve sandviç yöntemiyle de bakteri hücresinin, Whatman No.1 filtre kâğıdı üzerine degredatif etkisini belirlemek amacıyla, kâğıdın fiziksel yapısındaki değişimler dijital mikroskop görüntüleme ile, kimyasal yapı ve fonksiyonel gruplardaki değişimler FTIR-ATR analizleri ile ve renk değişimleri CIE L*a*b* renk ölçümleri ile değerlendirilmiştir. Fenotipik ve biyokimyasal özellikleri tanımlanan N. circulans suşunun endoglukanaz üretim potansiyeli farklı besiyerlerinde incelenmiş ve en yüksek enzim aktivitesine D besiyerinde ulaşılmıştır (13. gün: 0.13 U/mL). Bu bulgu doğrultusunda, enzim üretimi için en verimli ortam olarak D besiyeri belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmaları kapsamında bakterinin 18–45°C sıcaklık aralığında gelişim gösterebildiği; 37°C ve 45°C'deki büyüme düzeylerinin ise istatistiksel olarak benzerlik taşıdığı tespit edilmiştir. Bununla birlikte, endoglukanaz aktivitesinin örnekleme günlerinin genelinde 45°C'de daha yüksek seyretmesi ve maksimum aktivitenin bu sıcaklıkta (4. gün: 0.09 U/mL) kaydedilmesi nedeniyle, çalışmanın ilerleyen aşamalarında inkübasyon sıcaklığı 45°C olarak sabitlenmiştir. pH optimizasyonu verilerine göre N. circulans'ın pH 5–10 aralığında büyüme kapasitesine sahip olduğu ve en yüksek hücre yoğunluğunun pH 8'de (2. gün: 1.48 OD) gerçekleştiği görülmüştür. Ancak, endoglukanaz aktivitesinin çoğu örnekleme gününde pH 7'de daha yüksek değerler sergilemesi ve en yüksek aktivitenin pH 7'de (2. gün: 0.11 U/mL) ölçülmesi sebebiyle, enzim üretimi için optimum pH değeri 7 olarak seçilmiştir. D besiyerinde, optimum sıcaklık ve pH koşullarında 7 gün süreyle yürütülen kültür çalışmaları sonucunda elde edilen ham enzim preparatında, 5. gün hariç olmak üzere tüm örnekleme günlerinde en yüksek enzim aktivitesinin sırasıyla endoglukanaz, ekzoglukanaz ve FPaz olduğu belirlenmiştir. Whatman No.1 filtre kâğıdı üzerine ham enzim uygulaması sonucunda en yüksek toplam renk değişimi (ΔE), 7. günde 0.76 olarak ölçülmüş ve özellikle endoglukanaz aktivitesinin yüksek olduğu günlerde ΔE değerlerinin arttığı gözlenmiştir. FTIR-ATR analizlerinde, ham enzim uygulamasının özellikle 5. günde selüloz yapısında belirgin bir bozunma oluşturduğu görülmüştür. Bugünde, Toplam Kristallik İndeksi (TCI) değeri NW kontrolünde 1.413 iken 5. gün HW örneğinde 1.331'e düşmüş, buna karşılık Karbonil İndeksi (CI) 0.320'den 0.408'e yükselmiştir. Bu eş zamanlı TCI azalması ve CI artışı, özellikle ekzoglukanaz aktivitesinin maksimum olduğu 5. günde kristalin selüloz bölgelerinin aşınması ve oksidatif karakterli fonksiyonel grupların artışı ile uyumlu bir degradasyon sürecine işaret etmektedir. Sandviç yöntemi kullanılarak 5–75 gün boyunca izlenen uzun dönem deneylerde, hem MA hem de LBA yöntemlerinde BW örneklerinin parlaklık (L*) değerlerinde, NW örneklerine kıyasla genel bir azalma olduğu belirlenmiştir. Bu durum, bakteriyel etkinin kâğıt yüzeyindeki lif organizasyonunu bozarak ışık yansıtma özelliklerini olumsuz yönde etkilediğini göstermektedir. Parlaklık kaybının özellikle ileri inkübasyon evrelerinde daha belirgin hâle geldiği saptanmıştır. Δa* parametresi açısından yöntemler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmış olup, LBA yönteminde MA yöntemine kıyasla daha yüksek Δa* değerleri elde edilmiştir (p ≤ 0.05). Buna karşılık, Δb* parametresi açısından yöntemler arasında genel olarak anlamlı bir fark tespit edilememekle birlikte, özellikle 75. günde LBA yönteminde ölçülen Δb* değeri (Δb*: 3.32), MA'ya göre (Δb*: 1.84) daha yüksek bulunmuştur. Bu bulgular, özellikle LBA koşullarında bakteriyel etkinin kâğıt yüzeyinde sararma ile karakterize edilen bir degredasyona yol açtığını göstermektedir. Renk parametrelerinde gözlenen bu değişimler; dijital mikroskop görüntülerinde belirlenen lif yüzeyinin daha belirgin hale gelmesi, lifler arası boşlukların artması ve kenar düzensizlikleri ile uyumludur. Bu sonuçlar, sandviç yöntemi ile yürütülen deneylerde gerçekleşen degradasyonun yalnızca kimyasal değil, aynı zamanda yapısal ve optik düzeyde de ilerlediğini ortaya koymaktadır. Sandviç yöntemi boyunca kâğıt yapısında meydana gelen kimyasal ve yapısal değişimler FTIR-ATR analizleri ile izlenmiş; değerlendirmeler, bakteriyel etkinin özgül etkisini ortaya koyabilmek amacıyla BW ve NW örneklerinin doğrudan karşılaştırılması üzerinden gerçekleştirilmiştir. Bu karşılaştırma, inkübasyon koşullarının tek başına oluşturabileceği etkilerin dışlanmasını ve bakteriyel degradasyonun güvenilir biçimde değerlendirilmesini sağlamıştır. FTIR-ATR verilerinden hesaplanan TCI değerleri, özellikle ileri inkübasyon evrelerinde BW örneklerinde NW örneklerine kıyasla azalma eğilimi göstermiştir. Bu durum, sandviç yöntemi ile yürütülen deneylerde bakteriyel etkinin selülozun kristalin düzenini zayıflattığını ve mikrofibril paketlenmesini bozduğunu ortaya koymaktadır. Buna karşılık, CI değerlerinde BW–NW karşılaştırmalarında genel bir artış eğilimi gözlenmiş; bu artış, bakteriyel etkinin selüloz zincirlerinde oksidatif karakterli fonksiyonel grupların oluşumunu teşvik ettiğini göstermiştir. Hidrojen Bağı Yoğunluğu İndeksi (HBI) ve Yanal Düzen İndeksi (LOI) değerlerinin zamana ve yönteme bağlı olarak daha sınırlı ve dalgalı değişimler sergilemesi ise, degradasyon sürecinin tek yönlü bir ilerleme göstermediğini düşündürmektedir. Bu bağlamda FTIR bandları ve yapısal indekslerin birlikte değerlendirilmesi, LBA ve MA yöntemlerinde bakteriyel degradasyonun zamana bağlı olarak doğrusal bir seyir izlemediğini; amorflaşma, hidrojen bağı ağının yeniden düzenlenmesi ve yüzey erişilebilirliğindeki artışla karakterize edilen dinamik bir yapısal yeniden yapılanma sürecinin söz konusu olduğunu ortaya koymuştur. BW örneklerinde 1652 cm⁻¹, 1548 cm⁻¹ ve 897 cm⁻¹ bandlarında gözlenen değişimler, bağlı su içeriği ve biyofilm/EPS katkısını desteklerken, HBI, LOI ve CI değerlerindeki eş zamanlı değişimler bu yeniden düzenlenmeyi doğrulamaktadır. Sonuç olarak, N. circulans optimum koşullarda (45°C, pH 7) yüksek selülolitik kapasite göstermiş; ekzoglukanaz, endoglukanaz ve FPaz aktiviteleriyle selüloz temelli kâğıt yapısında ölçülebilir degradasyon oluşturmuştur. Ayrıca, ham enzim uygulaması, FTIR-ATR analizlerinde TCI azalması ve CI artışı ile tanımlanan yapısal değişimlere yol açarken, sandviç yöntemiyle yürütülen uzun süreli deneylerde bakteriyel etkinin zamana bağlı olarak arttığı; renk ölçümlerinde parlaklık azalması ve özellikle ileri inkübasyon evrelerinde sararma ile karakterize edilen belirgin optik değişimlerin ortaya çıktığı belirlenmiştir. Bu değişimler, dijital mikroskop görüntülerinde lif organizasyonunun bozulması ve yüzey heterojenliğinin artmasıyla da desteklenmiştir. Ek olarak, elde edilen bulgular, inkübasyon süresi, besiyeri bileşimi ve deneysel yaklaşımın kâğıt esaslı kültürel miras materyallerinde mikrobiyal bozunmanın düzeyini belirleyen kritik değişkenler olduğunu ortaya koymaktadır.

Özet (Çeviri)

Manuscripts are among the most important paper-based cultural heritage elements that reflect the cultural and scientific accumulation of a society. However, the high cellulose content of paper and the filling materials used in its production make these works sensitive to biological deterioration. Among the main biological deterioration agents effective on paper-based cultural heritage are cellulase-producing bacterial species. It is important to be able to detect the bacterial deterioration caused by bacteria on manuscripts, and at the same time to examine in detail the physico-chemical changes they create in paper. The bacterium Niallia circulans isolated from a manuscript is a Gram-positive, spore-forming and motile bacterial species with high cellulolytic activity. Although this bacterium has been frequently isolated in previous studies, there is no study that addresses its deteriorative effect on paper in a long-term and multidimensional manner. In this thesis study, first of all, it was aimed to define the physiological and biochemical properties of N. circulans, to determine the medium supporting the optimum production of the endoglucanase enzyme, and to determine the optimum temperature and pH conditions. Under these determined optimum conditions, endoglucanase activity was quantitatively analyzed using the DNS method with the unit U/mL by using carboxymethyl cellulose (CMC), exoglucanase activity using microcrystalline cellulose (MCC), and total cellulase activity using Whatman No.1 filter paper. In the continuation of the study, in order to determine the degradative effect of the crude enzyme obtained under optimum conditions and of the bacterial cell by the sandwich method on Whatman No.1 filter paper, changes in the physical structure of the paper were evaluated by digital microscope imaging, changes in chemical structure and functional groups by FTIR-ATR analyses, and color changes by CIE Lab* color measurements. The endoglucanase production potential of the N. circulans strain whose phenotypic and biochemical properties were defined was examined in different media, and the highest enzyme activity was reached in D medium (13th day: 0.13 U/mL). In line with this finding, D medium was determined as the most efficient environment for enzyme production. Within the scope of optimization studies, it was determined that the bacterium could grow in the temperature range of 18–45°C; and that the growth levels at 37°C and 45°C were statistically similar. However, since endoglucanase activity was higher at 45°C on most sampling days and the maximum activity was recorded at this temperature (4th day: 0.09 U/mL), the incubation temperature was fixed at 45°C in the subsequent stages of the study. According to the pH optimization data, N. circulans was observed to have growth capacity in the pH range of 5–10 and the highest cell density occurred at pH 8 (2nd day: 1.48 OD). However, because endoglucanase activity exhibited higher values at pH 7 on most sampling days and the highest activity was measured at pH 7 (2nd day: 0.11 U/mL), the optimum pH value for enzyme production was selected as 7. In the crude enzyme preparation obtained as a result of culture studies carried out for 7 days in D medium under optimum temperature and pH conditions, it was determined that the highest enzyme activity on all sampling days except the 5th day was, respectively, endoglucanase, exoglucanase and FPase. As a result of crude enzyme application on Whatman No.1 filter paper, the highest total color change (ΔE) was measured as 0.76 on the 7th day, and it was observed that ΔE values increased especially on the days when endoglucanase activity was high. In FTIR-ATR analyses, it was observed that crude enzyme application caused a significant deterioration in the cellulose structure especially on the 5th day. On this day, while the Total Crystallinity Index (TCI) value was 1.413 in the NW control, it decreased to 1.331 in the 5th day HW sample, whereas the Carbonyl Index (CI) increased from 0.320 to 0.408. This simultaneous decrease in TCI and increase in CI indicates a degradation process compatible with the abrasion of crystalline cellulose regions and the increase of oxidative-character functional groups, especially on the 5th day when exoglucanase activity was at maximum. In long-term experiments followed for 5–75 days using the sandwich method, it was determined that there was a general decrease in the brightness (L*) values of BW samples compared to NW samples in both MA and LBA methods. This shows that bacterial activity disrupts the fiber organization on the paper surface and negatively affects light reflection properties. It was determined that the loss of brightness became more pronounced especially in advanced incubation stages. In terms of the Δa* parameter, a statistically significant difference was detected between the methods, and higher Δa* values were obtained in the LBA method compared to the MA method (p ≤ 0.05). In contrast, although no generally significant difference was detected between the methods in terms of the Δb* parameter, especially on the 75th day the Δb* value measured in the LBA method (Δb*: 3.32) was found to be higher than that of MA (Δb*: 1.84). These findings show that, especially under LBA conditions, bacterial activity leads to a degradation characterized by yellowing on the paper surface. These changes observed in color parameters are compatible with the more pronounced appearance of the fiber surface, the increase in inter-fiber gaps and edge irregularities determined in digital microscope images. These results reveal that the degradation occurring in the experiments carried out with the sandwich method progresses not only at the chemical but also at the structural and optical levels. Chemical and structural changes occurring in the paper structure throughout the sandwich method were monitored by FTIR-ATR analyses; evaluations were carried out through direct comparison of BW and NW samples in order to reveal the specific effect of bacterial activity. This comparison ensured the exclusion of effects that incubation conditions alone could create and enabled reliable evaluation of bacterial degradation. TCI values calculated from FTIR-ATR data showed a decreasing trend in BW samples compared to NW samples, especially in advanced incubation stages. This reveals that bacterial activity weakens the crystalline order of cellulose and disrupts microfibril packing in the experiments carried out with the sandwich method. In contrast, a general increasing trend was observed in CI values in BW–NW comparisons; this increase showed that bacterial activity promotes the formation of oxidative-character functional groups in cellulose chains. The more limited and fluctuating changes of Hydrogen Bond Intensity Index (HBI) and Lateral Order Index (LOI) values depending on time and method suggest that the degradation process does not show a unidirectional progression. In this context, the combined evaluation of FTIR bands and structural indices revealed that bacterial degradation in LBA and MA methods does not follow a linear course depending on time; that a dynamic structural reorganization process characterized by amorphization, rearrangement of the hydrogen bond network and an increase in surface accessibility is in question. The changes observed in the 1652 cm⁻¹, 1548 cm⁻¹ and 897 cm⁻¹ bands in BW samples support bound water content and biofilm/EPS contribution, while the simultaneous changes in HBI, LOI and CI values confirm this reorganization. As a result, N. circulans showed high cellulolytic capacity under optimum conditions (45°C, pH 7); it created measurable degradation in the cellulose-based paper structure with exoglucanase, endoglucanase and FPase activities. In addition, while crude enzyme application led to structural changes defined by a decrease in TCI and an increase in CI in FTIR-ATR analyses, in long-term experiments carried out with the sandwich method it was determined that bacterial activity increased depending on time; that distinct optical changes characterized by a decrease in brightness in color measurements and yellowing especially in advanced incubation stages emerged. These changes were also supported by the disruption of fiber organization and the increase in surface heterogeneity in digital microscope images. In addition, the findings reveal that incubation time, medium composition and experimental approach are critical variables determining the level of microbial deterioration in paper-based cultural heritage materials.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    893389

    Yazma eserlerde tahribata neden olan mikrobiyal topluluğun moleküler düzeyde tanımlanması

    Identification of microbial community causing degradation in manuscripts at molecular level

    ESRA KELEŞ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Genetikİstanbul Kültür Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖZGE ÇELİK

  2. Tez No

    917966

    Buğday rizosferik topraklarından izole edilen ACC deaminaz üreticisi bakterilerinin izolasyonu ve potansiyellerinin değerlendirilmesi

    Isolation and evaluation of their potential of ACC deaminase producing bacteria isolated from wheat rhizospheric soils

    SÜMEYRA BAYRAK KOÇOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    MikrobiyolojiGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MİNE GÜL ŞEKER

  3. Tez No

    955500

    Kaplıca suyundan izole edilen ılımlı termofilik Niallia alba BT-5 amilazının üretimi, saflaştırılması, karakterizasyonu ve endüstriyel kullanım potansiyeli

    Production, purification, characterization and industrial use potential of amylase of moderate thermophilic Niallia alba BT-5 isolated from hot spring water

    BEHİYE TAŞER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    BiyokimyaAtatürk Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HAKAN ÖZKAN

Geri Dön