Geri Dön

Heterologous expression, characterization, and optimization of production of alpha-galactosidase from aspergillus fumigatus in aspergillus sojae

Aspergillus fumigatus alfa-galaktosidazinin aspergillus sojaede heterolog üretimi, karakterizasyonu ve üretiminin optimizasyonu

  1. Tez No: 313774
  2. Yazar: SÜMEYRA GÜRKÖK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL, PROF. DR. UFUK BÖLÜKBAŞI
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2012
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 205

Özet

?-Galaktosidaz enzimi oligosakkaritlerden, galaktomannanlardan ve galaktolipidlerden, indirgeyici olmayan, ?-1,6 bağlı galaktoz birimlerini hidroliz eden bir ekzo-glikosidazdır. ?-Galaktosidaz aktivitesi biyoteknolojik, endüstriyel ve medikal öneme sahiptir. Özellikle, A. fumigatus IMI 385708'un ?-galaktosidaz enzimi polimerik substratlar üzerinde farklı hidroliz ve transgalaktozilasyon reaksiyonlarını gerçekleştirebilmektedir. Bu çalışmada insan patojeni olan A. fumigatus IMI 385708'un ?-galaktosidaz enzimi ilk olarak genel olarak güvenli kabul edilen bir organizmada, Aspergillus sojae'de, üretildi. Bu amaçla, A. fumigatus IMI 385708'un ?-galaktosidaz geni (aglB) pAN52-4 (Acc. No: Z32699) vektörüne takılmış ve konstitütif A. nidulans gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz geninin (gpdA) promotörü ve A. niger glukoamilaz geninin (glaA) sinyal sekansı kontrolünde Aspergillus sojae ATCC11906'ye transfer edilmiştir. Bu keçiboynuzu zamkı yerine glukozda 3 kat volumetric üretim artışına karşılık gelen yüksek seviyede ?-galaktosidaz üretimine (2.45 U/mL) izin vermiştir. Daha sonra yanıt yüzey yöntemi kullanılarak, YpSs büyüme ortamındaki rekombinant A. sojae Ta1 kültürünün karbon ve nitrojen kaynağı ile çalkalama hızı optimize edilmiştir [(%10,5 melas (w/v); %1,3 NH4NO3 (w/v); 276 rpm]. Optimize edilmeyen kültürle karşılaştırıldığında, optimum şartlar altında ?-galaktosidaz üretiminde 4 kat daha artış sağlanmıştır (10.4 U/mL). Rekombinant ?-galaktosidaz anyon değişim ve hidrofobik etkileşim kromatografileriyle % 56 toplam verim ve 64.7 U/mg protein spesifik aktivite ile 18.7 kat saflaştırılmıştır. p-Nitrophenyl ?-D-galactopyranoside hidrolizi için Vmax ve Km değerleri sırasıyla 78 U/mg protein ve 0.45 mM olarak bulunmuştur. ?-Galaktosidaz aktivitesi için en uygun pH ve sıcaklık aralıkları sırasıyla pH 4?6 ve 50?60 °C olarak bulunmuştur. Test edilen kimyasal maddeler arasından biotin, I+1, Mn+2, Pb+2, Li+1 ve Mg+2 aktiviteyi % 12?29 artırırken, Ag+, Hg2+ ve Fe2+ aktiviteyi oldukça düşürmüştür. Osmotik stres etkisinin ?-galaktosidaz üretimini daha fazla artırmak amacıyla analizi için complete büyüme ortamına tuz eklenmiştir. Enzim üretimine ek olarak, fungusun büyüme ve morfolojisi tuza adapte olan ve olmayan A. sojae Ta1 hücrelerinde 1 M ve 2 M konsantrasyonda KCl, MgCl2, MgSO4, NaCl ve Na2SO4 varlığında incelenmiştir. Bu şekilde, 1 M NaCl varlığında adapte olmayan hücrelerle ?-galaktosidaz üretiminde 3 kat artış sağlanmıştır. A. sojae Ta1 hücrelerinin tuza maruz kalması normal şartlarda gözlenen pelet formu yerine çoğunlukla misel formuyla sonuçlanmıştır. Son olarak, ?-galaktosidazın transgalaktozilasyon yeteneği çalışılmıştır. TLC, ESI-MS ve HPLC analizlerine göre, ?-galaktosidaz p-nitrophenyl ?-D-galactopyranoside varlığında çeşitli monosakkarit ve disakkarite galaktoz transferini verimli bir şekilde katalizlemiştir.

Özet (Çeviri)

?-Galactosidase is an exo-glycosidase that hydrolyses non-reducing, ?-1,6-linked ?-galactose units from oligosaccharides, galactomannans, and galactolipids. ?-Galactosidase activity has biotechnological, industrial, and medical importance. ?-Galactosidase from A. fumigatus IMI 385708, in particular, can catalyse unique hydrolysis and transgalactosylation reactions on polymeric substrates. In this study, ?-galactosidase of the human pathogen A. fumigatus IMI 385708 was first produced in a GRAS organism, Aspergillus sojae. For this aim, ?-galactosidase gene (aglB) of A. fumigatus IMI 385708 was ligated onto pAN52-4 vector (Acc. No: Z32699) and transformed into Aspergillus sojae ATCC11906, under the control of the constitutive glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter (gpdA) of A. nidulans and the signal sequence of glucoamylase gene (glaA) of A. niger. This allowed high level of ?-galactosidase production on glucose instead of locust bean gum (2.45 U/mL), corresponding to a 3-fold increase in volumetric production. Next, using response surface methodology, carbon and nitrogen sources and agitation speed were optimized (10.5% molasses (w/v); 1.3% NH4NO3 (w/v); 276 rpm). Compared to non-optimized cultivation, a further 4-fold increase in ?-galactosidase production (10.4 U/mL) was achieved. Recombinant ?-galactosidase was purified 18.7-fold using Anion Exchange and Hydrophobic Interaction Chromatography with an overall yield of 56% and 64.7 U/mg protein. The Vmax and Km values for the hydrolysis of p-nitrophenyl ?-D-galactopyranoside were 78 U/mg protein and 0.45 mM, respectively. Optimum pH and temperature for ?-galactosidase activity were between pH 4?6 and 50?60 °C, respectively. Among the tested chemical agents, Ag+, Hg2+, and Fe2+ drastically decreased the activity, while biotin, I+1, Mn+2, Pb+2, Li+1, and Mg+2 enhanced between 12?29%. To analyse the influence of osmotic stress as a means of further inducing ?-galactosidase production, salt was added into the complete growth medium. In addition to enzyme production, fungal growth and morphology were analysed for both `salt-adapted? and `salt non-adapted? A. sojae Ta1 cells in the presence of KCl, MgCl2, MgSO4, NaCl, and Na2SO4 at 1 M and 2 M. Accordingly, 3-fold increase in ?-galactosidase production was achieved by non-adapted cells in the presence of 1 M NaCl. Exposure of A. sojae Ta1 cells to salt resulted in predominantly mycelial form, rather than the pellet form observed under normal conditions. Finally, the transgalactosylation ability of ?-galactosidase was studied. ?-Galactosidase efficiently catalysed galactose transfer to different monosaccharides and disaccharides in the presence of pNP?Gal as monitored by TLC, ESI-MS, and HPLC.

Benzer Tezler

  1. Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu

    Recombinant expression and characterization of a novel endoglucanase enzyme obtained by metagenomics approach

    FURKAN ABDULLAH ÇALIŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiYıldız Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU

    DR. GÜNSELİ KURT GÜR

  2. Cloning and heterologous expression of a laccase isozyme gene from Coriolopsis polyzona MUCL 38443

    Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz izoenzimi kodlayan genin klonlanması ve ifade edilmesi

    ÖZNUR PEHLİVAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

  3. Cloning of a cDNA encoding laccase from coriolopsis polyzona MUCL 38443 and expression in Pichia pastoris

    Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz kodlayan bir cDNA'nın klonlanması ve Pichia pastoris'te ifade edilmesi

    ORKUN PİNAR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

  4. Cloning, characterization and heterologons expression of the aspartokinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase genes from the cephamycin C producer streptomyces clavuligerus

    Sefamisin C üreticisi streptomyces davuligerus'un aspartokinaz ve aspartat semialdehid dehidrojenaz genlerinin klonlanması, karakterizasyonu ve heterolog ekspresyonu

    SEDEF TUNCA

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2002

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ

    PROF. DR. JACQUELİNE PİRET

  5. Expression and biochemical characterization of Hypsibius dujardini epoxide hydrolase enzyme in Pichia pastoris

    Başlık çevirisi yok

    HAKAN ONUR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyokimyaGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY