Heterologous expression, characterization, and optimization of production of alpha-galactosidase from aspergillus fumigatus in aspergillus sojae
Aspergillus fumigatus alfa-galaktosidazinin aspergillus sojaede heterolog üretimi, karakterizasyonu ve üretiminin optimizasyonu
- Tez No: 313774
- Danışmanlar: PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL, PROF. DR. UFUK BÖLÜKBAŞI
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2012
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 205
Özet
?-Galaktosidaz enzimi oligosakkaritlerden, galaktomannanlardan ve galaktolipidlerden, indirgeyici olmayan, ?-1,6 bağlı galaktoz birimlerini hidroliz eden bir ekzo-glikosidazdır. ?-Galaktosidaz aktivitesi biyoteknolojik, endüstriyel ve medikal öneme sahiptir. Özellikle, A. fumigatus IMI 385708'un ?-galaktosidaz enzimi polimerik substratlar üzerinde farklı hidroliz ve transgalaktozilasyon reaksiyonlarını gerçekleştirebilmektedir. Bu çalışmada insan patojeni olan A. fumigatus IMI 385708'un ?-galaktosidaz enzimi ilk olarak genel olarak güvenli kabul edilen bir organizmada, Aspergillus sojae'de, üretildi. Bu amaçla, A. fumigatus IMI 385708'un ?-galaktosidaz geni (aglB) pAN52-4 (Acc. No: Z32699) vektörüne takılmış ve konstitütif A. nidulans gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz geninin (gpdA) promotörü ve A. niger glukoamilaz geninin (glaA) sinyal sekansı kontrolünde Aspergillus sojae ATCC11906'ye transfer edilmiştir. Bu keçiboynuzu zamkı yerine glukozda 3 kat volumetric üretim artışına karşılık gelen yüksek seviyede ?-galaktosidaz üretimine (2.45 U/mL) izin vermiştir. Daha sonra yanıt yüzey yöntemi kullanılarak, YpSs büyüme ortamındaki rekombinant A. sojae Ta1 kültürünün karbon ve nitrojen kaynağı ile çalkalama hızı optimize edilmiştir [(%10,5 melas (w/v); %1,3 NH4NO3 (w/v); 276 rpm]. Optimize edilmeyen kültürle karşılaştırıldığında, optimum şartlar altında ?-galaktosidaz üretiminde 4 kat daha artış sağlanmıştır (10.4 U/mL). Rekombinant ?-galaktosidaz anyon değişim ve hidrofobik etkileşim kromatografileriyle % 56 toplam verim ve 64.7 U/mg protein spesifik aktivite ile 18.7 kat saflaştırılmıştır. p-Nitrophenyl ?-D-galactopyranoside hidrolizi için Vmax ve Km değerleri sırasıyla 78 U/mg protein ve 0.45 mM olarak bulunmuştur. ?-Galaktosidaz aktivitesi için en uygun pH ve sıcaklık aralıkları sırasıyla pH 4?6 ve 50?60 °C olarak bulunmuştur. Test edilen kimyasal maddeler arasından biotin, I+1, Mn+2, Pb+2, Li+1 ve Mg+2 aktiviteyi % 12?29 artırırken, Ag+, Hg2+ ve Fe2+ aktiviteyi oldukça düşürmüştür. Osmotik stres etkisinin ?-galaktosidaz üretimini daha fazla artırmak amacıyla analizi için complete büyüme ortamına tuz eklenmiştir. Enzim üretimine ek olarak, fungusun büyüme ve morfolojisi tuza adapte olan ve olmayan A. sojae Ta1 hücrelerinde 1 M ve 2 M konsantrasyonda KCl, MgCl2, MgSO4, NaCl ve Na2SO4 varlığında incelenmiştir. Bu şekilde, 1 M NaCl varlığında adapte olmayan hücrelerle ?-galaktosidaz üretiminde 3 kat artış sağlanmıştır. A. sojae Ta1 hücrelerinin tuza maruz kalması normal şartlarda gözlenen pelet formu yerine çoğunlukla misel formuyla sonuçlanmıştır. Son olarak, ?-galaktosidazın transgalaktozilasyon yeteneği çalışılmıştır. TLC, ESI-MS ve HPLC analizlerine göre, ?-galaktosidaz p-nitrophenyl ?-D-galactopyranoside varlığında çeşitli monosakkarit ve disakkarite galaktoz transferini verimli bir şekilde katalizlemiştir.
Özet (Çeviri)
?-Galactosidase is an exo-glycosidase that hydrolyses non-reducing, ?-1,6-linked ?-galactose units from oligosaccharides, galactomannans, and galactolipids. ?-Galactosidase activity has biotechnological, industrial, and medical importance. ?-Galactosidase from A. fumigatus IMI 385708, in particular, can catalyse unique hydrolysis and transgalactosylation reactions on polymeric substrates. In this study, ?-galactosidase of the human pathogen A. fumigatus IMI 385708 was first produced in a GRAS organism, Aspergillus sojae. For this aim, ?-galactosidase gene (aglB) of A. fumigatus IMI 385708 was ligated onto pAN52-4 vector (Acc. No: Z32699) and transformed into Aspergillus sojae ATCC11906, under the control of the constitutive glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter (gpdA) of A. nidulans and the signal sequence of glucoamylase gene (glaA) of A. niger. This allowed high level of ?-galactosidase production on glucose instead of locust bean gum (2.45 U/mL), corresponding to a 3-fold increase in volumetric production. Next, using response surface methodology, carbon and nitrogen sources and agitation speed were optimized (10.5% molasses (w/v); 1.3% NH4NO3 (w/v); 276 rpm). Compared to non-optimized cultivation, a further 4-fold increase in ?-galactosidase production (10.4 U/mL) was achieved. Recombinant ?-galactosidase was purified 18.7-fold using Anion Exchange and Hydrophobic Interaction Chromatography with an overall yield of 56% and 64.7 U/mg protein. The Vmax and Km values for the hydrolysis of p-nitrophenyl ?-D-galactopyranoside were 78 U/mg protein and 0.45 mM, respectively. Optimum pH and temperature for ?-galactosidase activity were between pH 4?6 and 50?60 °C, respectively. Among the tested chemical agents, Ag+, Hg2+, and Fe2+ drastically decreased the activity, while biotin, I+1, Mn+2, Pb+2, Li+1, and Mg+2 enhanced between 12?29%. To analyse the influence of osmotic stress as a means of further inducing ?-galactosidase production, salt was added into the complete growth medium. In addition to enzyme production, fungal growth and morphology were analysed for both `salt-adapted? and `salt non-adapted? A. sojae Ta1 cells in the presence of KCl, MgCl2, MgSO4, NaCl, and Na2SO4 at 1 M and 2 M. Accordingly, 3-fold increase in ?-galactosidase production was achieved by non-adapted cells in the presence of 1 M NaCl. Exposure of A. sojae Ta1 cells to salt resulted in predominantly mycelial form, rather than the pellet form observed under normal conditions. Finally, the transgalactosylation ability of ?-galactosidase was studied. ?-Galactosidase efficiently catalysed galactose transfer to different monosaccharides and disaccharides in the presence of pNP?Gal as monitored by TLC, ESI-MS, and HPLC.
Benzer Tezler
- Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Recombinant expression and characterization of a novel endoglucanase enzyme obtained by metagenomics approach
FURKAN ABDULLAH ÇALIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
DR. GÜNSELİ KURT GÜR
- Cloning and heterologous expression of a laccase isozyme gene from Coriolopsis polyzona MUCL 38443
Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz izoenzimi kodlayan genin klonlanması ve ifade edilmesi
ÖZNUR PEHLİVAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Cloning of a cDNA encoding laccase from coriolopsis polyzona MUCL 38443 and expression in Pichia pastoris
Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz kodlayan bir cDNA'nın klonlanması ve Pichia pastoris'te ifade edilmesi
ORKUN PİNAR
Doktora
İngilizce
2017
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Cloning, characterization and heterologons expression of the aspartokinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase genes from the cephamycin C producer streptomyces clavuligerus
Sefamisin C üreticisi streptomyces davuligerus'un aspartokinaz ve aspartat semialdehid dehidrojenaz genlerinin klonlanması, karakterizasyonu ve heterolog ekspresyonu
SEDEF TUNCA
Doktora
İngilizce
2002
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ
PROF. DR. JACQUELİNE PİRET
- Expression and biochemical characterization of Hypsibius dujardini epoxide hydrolase enzyme in Pichia pastoris
Başlık çevirisi yok
HAKAN ONUR
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyokimyaGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY