Geri Dön

Cloning and heterologous expression of a laccase isozyme gene from Coriolopsis polyzona MUCL 38443

Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz izoenzimi kodlayan genin klonlanması ve ifade edilmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 485300
  2. Yazar: ÖZNUR PEHLİVAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 113

Özet

Dünyada en çok bulunan biyokütleler arasında lignoselüloz, selüloz, hemiselüloz ve lignin polimeri bulunur. Lignin, odunsu bitkilerin en dış katmanında bulunur ve yapısının heterojen olması sebebiyle parçalanması zordur. Ligninin biyoparçalanması, küresel karbon döngüsü ve lignoselülozik hammaddelerin kullanıldığı endüstriyel uygulamalar açısından önem arz eder. Doğadaki bazı özel mantar türleri, lignin biyoparçalanmasını gerçekleştirebilmektedir. Bunlar arasında beyaz çürükçül mantarlar lignoselülozik kompleksleri parçalayabilme özelliğine sahip çoklu enzim sistemlerine sahip olmaları bakımından önemlidirler. Basidiyomisitler, lakkaz benzeri oksidatif enzimler üretip hücre dışına salgılayarak tüm odunsu lignoselüloz bileşiklerin yumuşak ve sert odunsu kısımlarının çürümesini sağlayabilirler. Basidiyomisit şubesinde bulunan Coriolaceae ailesine ait Coriolopsis polyzona, ligninolitik enzim üreticisi olan beyaz çürükçül bir mantardır. Lakkkazlar (EC 1.10.3.2) fenolik ve fenolik olmayan lignin temelli bileşiklerin oksidasyon reaksiyonunu oksijenin suya indirgenmesi reaksiyonuyla birleştirerek katalizleyebilen enzimlerdir. Lakkazlar, genellikle monomerik yapıda bulunan ve hücre dışına salgılanan glikoproteinlerdir. Lakkazlar, kâğıt, meyve suyu ve tekstil endüstrisi atık sularının detoksifikasyonu, tarımda kullanılan pestisit ve herbisitlerin biyoremediasyonu, medikal tanı ve biyosensör üretimi gibi pek çok alandaki uygulamalarda kullanımları sebebiyle önemlidirler. Fungus türleri farklı çevre koşullarında birden fazla lakkaz izoenzimi üretebilirler. Aynı suş tarafından üretilseler dahi biyokimyasal özellik ve enzim aktiviteleri bakımından farklılık göstermeleri sebebiyle yeni bir lakkaz olma olasılığı bulunan lakkaz izoenzimlerinin izole edilmesi ve detaylı karakterizasyonun yapılması gerekmektedir. Bu araştırmalar, lakkazların organizmalardaki fizyolojik rollerinin anlaşılmasının yanı sıra biyolojik uygulamalarda kullanılabilecek daha uygun lakkaz enzimlerinin bulunması bakımından önemlidir. Araştırma grubumuzun daha önceki çalışmalarında, beyaz çürükçül küf mantarı Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşunda, lakkaz izoenzimlerine ait üç farklı kısmî cDNA sekansları, Cplcc1, Cplcc2 and Cplcc3, karakterize edilmiştir. BLAST analizi sonucunda bu kısmî sekanslar daha önce National Center for Biotechnology Information (NCBI) veritabanına yüklenmiş lakkaz kodlayan sekanslarla yaklaşık %80 benzerlik gösterdiği gösterilmiştir. Grubumuzda yürütülen çalışmalar neticesinde öncelikle, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşundaki Cplcc1 ve sonrasında Cplcc2 lakkazına ait tam boy cDNA dizileri elde edilerek, karakterize edilmiştir. Bu bulguların devamı olarak planlanan bu çalışmada, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşundaki Cplcc3 kısmî cDNA'sına ait tam boy cDNA dizisi izolasyonu, karakterizasyonu ve Pichia pastoris X-33 suşunda ekspresyonu amaçlanmıştır. Cplcc3 kısmî cDNA dizisine özel dizayn edilen RACE primerleriyle, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 total RNA'sı kalıp olarak kullanılarak 5' ve 3' RACE reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. 5' ve 3' cDNA uçlarını içeren reaksiyon ürünleri dizilenmiş ve analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu analizler sonucunda Cplcc3 adlandırılan kısmî cDNA dizisinin, gerçekte CpLcc2 korunmuş bakır I ve IV bölgesini içeren geninin bir parçası olduğu ortaya çıkarılmıştır. Cplcc2 genine ait açık okuma çerçevesi daha önceki çalışmada pGEMT-Easy PZR klonlama vektörüne klonlanmış ve karakterizasyonu yapılmıştır. Bu sebeple, çalışmamızın amacına uygun olarak, doğruluğu kontrol edilmiş olan Cplcc2 açık okuma çerçevesi kesim enzimleri ile kesilip çıkarılmış ve maya mekik ekspresyon vektörün pPICZB'ye klonlanmıştır. Cplcc2 geni kendi sinyal sekansı ile klonlanarak, ifade edileceği konak organizmada üretildikten sonra hücre dışına salınması amaçlanmıştır. Rekombinant vektör metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris transformasyonunda kullanılmış ve Cplcc2 lakkazının heterolog olarak ifade edilmesi sağlanmıştır. Transformantların rekombinant CpLcc2 lakkaz üretimi ve salınımı, ABTS içeren minimal besi yerlerinde kontrol edilmiştir. Lakkaz üreten ve salınımı yapan transformantların etrafında yeşil alan oluşturduğu gözlemlenmiştir. Lakkaz üreten 16 transformanttan en iyi üretim yapan transformant, metanol içeren sıvı besi yerinde büyütülerek ve alınan örneklere lakkaz aktivitesi deneyi yapılarak belirlenmiştir. En iyi üretim yapan koloni X33-8 olarak belirlenmiştir. En iyi üretim koşullarını belirlemek amacıyla, enzim üretimine ve aktivitsine etkisi olabilecek faktörler optimize edilmiştir. Bu amaçla, farklı büyüme ortamlarının, metanol konsantrasyonunun, bakır konsantrasyonunun, L-Alanin konsantrasyonunun ve büyüme sıcaklığının etkisi araştırımıştır. Bu çalışma sonucunda optimum koşullar, BMGY/BMMY büyüme ortamı içerisinde % 1.5 metanol, 0.8 mM bakır sülfat ve % 0.4 L-alanin eklendikten sonra 250 rpm ve 28°C olarak saptanmıştır. Elde edilen optimum koşullar, grubumuzda daha önce karakterize edilen, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 organizmasına ait, rekombinant CpLcc1 lakkazı ile benzerlik göstermektedir. Rekombinant CpLcc2 lakkazı optimizasyonu yapılan koşullarda üretilmiş ve üretim ortamına salınan enzimin aktivitesi lakkaz aktivitesi deneyi ile belirlenmiştir. En yüksek rekombinant CpLcc2 lakkaz aktivitesi 1159.041 U/l olarak belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonucunda lakkaz aktivitesi 17.37 kat arttırıldığı gözlemlenmiştir. Rekombinant olarak ifade edilen CpLcc2 lakkazının aktivitesinin, rekombinant olarak edilen CpLcc1 lakkazından yüksek olduğu belirlenmiş ve Cplcc2 lakkazının ifade seviyeleri göz önünde bulundurularak endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamalara daha uygun olabileceği düşünülmektedir. Optimize edilen koşullara göre üretilen rekombinant lakkaz CpLcc2 lakkazının yaklaşık moleküler ağırlığı Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edilmiş ve SDS-PAGE moleküler ağırlık standart eğrisi oluşturularak 72.4 kDa olarak belirlenmiştir. Belirlene bu moleküler ağırlık, daha önce çalışılmış Coriolopsis polyzona WR710-1 suşundan elde edilen 71 kDa büyüklüğündeki nativ lakkazla tutarlılık göstermiştir. Rekombiant Cplcc2'nin SDS-PAGE ile belirlenen molekül ağırlığının, protein sekansına göre belirlenen hipotetik moleküler ağırlıktan fazla olduğu belirlenmiştir. Bu fazla ağırlık, rekombinant enzimin ifade edildiği konak organizmada gerçekleştirilen glikozilasyondan kaynaklanabileceği ve glikozilasyon seviyesinin %28.3 olabileceği belirlenmiştir. Bu glikozilasyon seviyesinin, fungus orijinli lakkazlarda görülenden daha yüksek olduğu ifade edilmiştir. Bunun yanı sıra, daha önce aynı organizmadan rekombinant olarak üretilen Coriolopsis polyzona MUCL 38443'e ait CpLcc1 lakkazında böyle bir glikozilasyon belirlenmemiştir. Pichia pastoris konakçısında, optimum koşullarda üretildikten sonra, CpLcc1'e kıyasla elde edilen total aktiviter göz önünde bulundurulduğunda CpLcc2 aktivitesinin daha yüksek olmasının CpLcc2'de görülen glikozilasyondan kaynaklandığı düşünülmektedir.

Özet (Çeviri)

Laccases (EC 1.10.3.2) are enzymes which catalyze oxidation of phenolic and non-phenolic lignin-related compounds coupled with reduction of oxygen to water. Laccases belongs to a protein superfamily which includes multicopper oxidases (MCO). Laccases are highly interested enzymes as a result of their beneficial applications in detoxification of industial effluents from the paper, pulp and textile industries and bioremediation of the herbicides and pesticides along with their applications in beverage industry and medical diagnosis. Three different partial cDNA sequences, Cplcc1, Cplcc2 and Cplcc3, which belongs to laccase isozymes from white-rot fungus Coriolopsis polyzona MUCL 38443 strain were previously identified by our research group. These partial sequences showed around 80% similarity via with laccase-encoding sequences, which were previously submitted to National Center for Biotechnology Information (NCBI) database, via BLAST analysis. Subsequently, first, full-lenght Cplcc1 cDNA and, next, full-length Cplcc2 cDNA were isolated and characterized in our group. In the present study, characterization of full-length cDNA belongs to Cplcc3 partial cDNA sequences, cloning of the full-length gene into yeast expression vector pPICZB and heterologous expression of the protein were aimed. Initially, cDNA ends belong to partial Cplcc3 cDNA were characterized. With this characterization, it was clarified that this partial cDNA belongs to Cplcc2 gene of Coriolopsis polyzona. After that, full-length Cplcc2 open-reading frame was cloned into the yeast shuttle expression vector pPICZB with its own secretion signal sequence. Cplcc2 was heterologously expressed in methylotrophic yeast Pichia pastoris. CpLcc2 expression and secretion in yeast transformants were, first-screened in the expression-inducing media. CpLcc2-expressing transformants were, then screened in methanol-containing broth media in order to select best enzmye-producing transformant after applying laccase assay to the daily-collected samples for 3 days. Moreover, expression conditions of CpLcc2 was optimized to achieve production of laccase enzymes at highest level. In order to do so, cultivation conditions, methanol concentration, copper concentration, L-Alanine concentration and growth temperature were optimized. Optimum conditions for CpLcc2 expression were determined as 1.5% methanol, 0.8 mM CuSO4, 0.4% L-alanine at 28°C with 250 rpm shaking and 7 days of incubation. Optimal expression conditions were found to be similar to the recombinant CpLcc1 laccase previously isolated from Coriolopsis polyzona MUCL 38443. Maximum CpLcc2 laccase activity was found as 1159.041 U/L, which was higher than the recombinant Cplcc1 (800U/l). Molecular weight of Cplcc2 was determined according to SDS-PAGE analysis as 72.4 kDa, which is higher than hypothetical molecular weight of enzyme due to glycosylation in the expression host. Most probably, this glycosylation was stated as the reason for higher activity of CpLcc2 than CpLcc1. Molecular weight of recombinant Cplcc2 was found consistent with laccase from Coriolopsis polyzona WR710-1. Level of glycosylation was found more than most fungal laccases.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    166993

    PCR cloning and heterologous expression of scytalidium thermophilum laccase gene in aspergillus sojae

    Scytalidium thermophilum lakkaz geninin PCR tekniği ile klonlanması ve Aspergillus Sojae'de heterolog ekspresyonu

    GÜLDEN KOÇLAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2005

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖĞEL

    PROF. DR. UFUK BAKIR

  2. Tez No

    315382

    Cloning of The Laccase cDNAs from Pycnoporus sanguineus MUCL 38531, Expression in Pichia pastoris and Characterization of Recombinant Laccases

    Pycnoporus sanguineus?tan Lakkaz cDNA?larının Klonlanması, Pichia pastoris?te Ekspresyonu ve Rekombinant Lakkazların Karakterizasyonu

    GÜNSELİ KURT GÜR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  3. Tez No

    450935

    Cloning of a cDNA encoding laccase from coriolopsis polyzona MUCL 38443 and expression in Pichia pastoris

    Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz kodlayan bir cDNA'nın klonlanması ve Pichia pastoris'te ifade edilmesi

    ORKUN PİNAR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

  4. Tez No

    688110

    Halofilik bir candida türünden NAD+-bağımlı format dehidrogenaz geninin klonlanması ve heterolog ekspresyonu

    Cloning and heterologous expression of the NAD+-dependent formate dehydrogenase gene from a halophilic candida species

    ÖZGE BAŞSARAÇ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyolojiYıldız Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU

    ÖĞR. GÖR. GÜNSELİ KURT GÜR

  5. Tez No

    172239

    Cloning and expression of periplasmic (CLpP-LIKE) and memrane-bound serine protease genes of thermoplasma volcanium in escherichia coli

    Thermoplasma volcaniumun periplazmik (CLpP-benzeri) ve membrana-bağlı serin proteaz enzim genlerinin escherichia colide klonlanması ve anlatımı

    BURÇAK DEMİROK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2006

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    PROF.DR. SEMRA KOCABIYIK

Geri Dön