Geri Dön

Recombinant transglutaminase production by metabolically engineered Pichia pastoris

Metabolik mühendislik teknikleriyle modifiye edilmiş Pichia pastoris kullanarak rekombinant transglutaminaz üretimi

PDF İndir

  1. Tez No: 313776
  2. Yazar: BURCU GÜNDÜZ
  3. Danışmanlar: PROF. PINAR ÇALIK, DR. REMZİYE YILMAZ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2012
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 211

Özet

Transglutaminazlar (EC 2.3.2.13) proteinlerin glutaminil gruplarının ?-karboksil grupları ve lisin de dahil olmak üzere çeşitli birincil aminler arasındagerçekleşen açil transfer reaksiyonunu katalizleyen enzimlerdir.Transglutaminaz enzimi, yeni fonksiyonel özelliklerde protein üretimi, elzemamino asitlerin yapıya eklenmesi ile gıdaların besin değerinin geliştirilmesi,ısıya dayanıklı jellerin oluşturulması, gıdaların reolojik özelliklerinin ve mekanikdayanımının geliştirilmesi ve gıda katkı maddelerinin kullanımının azaltılmasıiçin kullanılma potansiyeline sahip bir enzimdir.Bu yüksek lisans çalışmasının amacı, hücreiçi ve hücredışı mikrobiyalprotransglutaminaz (pro-MTG) üreten rekombinant Pichia pastoris suşlarınınmetabolik mühendislik teknikleri kullanılarak geliştirilmesidir. Bu kapsamda ilkolarak, Streptomyces mobaraensis'in protransglutaminaz geni hücreiçi vehücredışı olarak ayrı ayrı üretim yapmak amacıyla pPICZ?-A ekspresyonvektörlerine ayrı ayrı klonlanmıştır. Hücreiçi (pPICZ?A::pro-mtgintra) vehücredışı (pPICZ?A::pro-mtgintra) üretim için geliştirilen plazmidler P. pastorisX33 genomunda bulunan AOX1 lokusuna klonlanmış ve pro-mtg genininmetanolle indüklenen alkol oksidaz promoter vasıtasıyla ekspresyonusağlanmıştır. Rekombinant Pichia pastoris suşlarının hazırlanmasından sonra,kesikli çalkalayıcılı biyoreaktör deneyleri her bir rekombinant hücre içinyapılmış ve en iyi üretim yapan suşlar Dot blot ve SDS-PAGE analizleri ileseçilmiştir. Genomlarında pPICZ?A::pro-mtgextra ve pPICZ?A::pro-mtgintragenlerini taşıyan seçilmiş rekombinant hücreler sırasıyla E8 ve I1 olarakadlandırılmışlardır.Pilot ölçekli 1 L çalışma hacmına sahip kontrollu biyoreaktör deneyi E8klonu ile gerçekleştirilmiş ve üretilen pro-MTG Dispase I ile aktive edilerekMTG enzimi elde edilmiştir. Biyoproses süresince rekombinant MTG aktivitesi,hücre derişimi, toplam proteaz aktivitesi, AOX aktivitesi ve organik asitderişimlerindeki değişimler analiz edilerek spesifik çoğalma hızı, spesifiktüketim hızı ve verim katsayıları hesaplanmıştır. Maksimum 4448 U L-1 MTGaktivitesi ve maksimum 74.1 g L-1 hücre derişimi t=36 st'te elde edilmiştir. Buçalışmayla, Pichia pastoris tarafından hücre dışı aktif transglutaminaz enzimüretimi ilk kez gerçekleştirilmiştir ve üçüncü en yüksek hücre dışı MTGaktivitesi E8 klonu ile elde edilmiştir.

Özet (Çeviri)

Transglutaminases (EC 2.3.2.13) are enzymes that catalyze an acyltransfer reaction between a ?-carboxyamide group of a peptide boundglutaminyl residue (acyl donor) and a variety of primary amines (acylacceptors), including the amino group lysine. Transglutaminase has a potentialin obtaining proteins with novel properties, improving nutritional quality offoods with the addition of essential amino acids, preparing heat stable gels,developing rheological properties and mechanical strength of foods andreducing the applications of food additives.The aim of this study is to develop intracellular and extracellularmicrobial protransglutaminase (pro-MTG) producing recombinant Pichiapastoris strains by using genetic engineering techniques. In this context first,protransglutaminase gene (pro-mtg) from Streptomyces mobaraensis wasamplified by PCR both for intracellular and extracellular constructs usingproper primers then they were cloned into the pPICZ?-A expression vectors,separately. Both intracellular (pPICZ?A::pro-mtgintra) and extracellular(pPICZ?A::pro-mtgextra) constructs were prepared with strong alcohol oxidase1 promoter which is induced by methanol. Pichia pastoris X33 cells weretransfected by linear pPICZ?A::pro-mtgintra and pPICZ?A::pro-mtgextra,separately and plasmids were integrated into the Pichia pastoris X33 genome atAOX1 locus. After constructing the recombinant P. pastoris strains, batchshaker bioreactor experiments were performed for each recombinant cell andthe best producing strains were selected according to Dot blot and SDS-PAGEanalyses. The selected recombinant P. pastoris strains, carrying pPICZ?A::promtgextragene and pPICZ?A::pro-mtgintra gene in their genome were named asE8 and I1, respectively.Afterwards, a controlled pilot scale bioreactor experiment in aworking volume of 1 L was performed with E8 clone and produced pro-MTGwas activated by Dispase I. The variations in the recombinant MTG activity, cellconcentration, total protease activity, AOX activity and organic acidconcentrations throughout the bioprocess were analyzed and specific growthrates, specific consumption rates and yield coefficients were calculatedregarding to measured data. Maximum MTG activity was obtained as 4448 U L-1 and the maximum cell concentration was measured as 74.1 g L-1 at t=36 h ofthe bioprocess. In this study, an active transglutaminase enzyme wasproduced extracellularly by P. pastoris for the first time and the third highestextracellular MTG activity was achieved with E8 clone.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    847253

    Extracellular production of recombinant microbial transglutaminase enzyme in Pichia pastoris

    Rekombinant mikrobiyal transglutaminaz enziminin Pichia pastoris'te hücre dışı üretimi

    LEYLA NUR KORKMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYSUN ÖZÇELİK

  2. Tez No

    668652

    Production of enzymes for food industry via solid state fermentation and optimization of process conditions

    Katı hal fermantasyonu ve proses koşullarının optimizasyonu yoluyla gıda endüstrisi için enzimlerin üretimi

    BAHTIR HYSENI HYSENI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyomühendislikYeditepe Üniversitesi

    Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ İLKEM EMRAH NİKEREL

  3. Tez No

    462558

    Rekombinant granülosit koloni uyarıcı faktörün biyopolimerlerle enzimatik konjugasyonu ve proteinin özellikleri üzerindeki etkilerinin araştırılması üzerinde çalışmalar

    Enzymatic conjugation of recombinant granulocyte colony stimulating factor with biopolymers and studies on the effects on protein properties

    AYŞE GÖKSU KAYA ÖZSAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    BiyoteknolojiHacettepe Üniversitesi

    Farmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE FİLİZ ÖNER

  4. Tez No

    772209

    Recombinant production and characterization of a novel N-glycosidase (EndoBI-2) from Bifidobacterium longum subsp. infantis 157F

    Recombinant production and characterization of a novel n-glycosidase (EndoBI-2) from Bifidobacterium longum subsp.infantis 157F

    HATİCE DUMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERCAN KARAV

  5. Tez No

    794635

    İnsan Kemik Morfogenetik Protein 2'nin (BMP2) rekombinant olarak üretilmesi, biyokimyasal karakterizasyonu ve biyolojik aktivitelerinin araştırılması

    Recombinant expression, biochemical characterization and biological activities of the Human Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2)

    YASİN AYDIN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSA GÖKÇE

Geri Dön