Geri Dön

Extracellular production of recombinant microbial transglutaminase enzyme in Pichia pastoris

Rekombinant mikrobiyal transglutaminaz enziminin Pichia pastoris'te hücre dışı üretimi

  1. Tez No: 847253
  2. Yazar: LEYLA NUR KORKMAZ
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. AYSUN ÖZÇELİK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 54

Özet

Biyoteknolojik gelişmeler hızla ilerlerken, enzimler gıda sektöründe ve diğer pek çok alanda üretimin iyileştirilmesi, verimlilik ve kalite artışı için kullanılmaktadır. Transglutaminaz enzimi uzun zamandır biyoloteknoloji alanında gıda katkı maddesi olarak kullanılan ve pek çok organizma tarafından sentezlenebilen bir enzimdir. Metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris (P. pastoris) ekspresyon sistemi, son yıllarda birçok rekombinant proteinin üretiminde hem araştırma hem de endüstriyel amaçlarla başarıyla kullanılmaktadır ve en etkili heterolog protein ekspresyon sistemlerinden biridir. Bu çalışmada, Streptomyces mobaraensis mikrobiyal transglutaminaz (MTGaz) enziminin P. pastoris'te alkol dehidrojenaz (ADH) promotoru kontrolünde hücre dışı ekspresyonu yapılmıştır. Bu amaçla, öncelikle pADH2α-proMTGase ekspresyon vektörü oluşturulmuş ve P. pastoris KM71 suşuna transforme edilmiştir. Zeosin antibiyotikli agar plakalarda seçilen transformant Pichia klonları ile çalkalamalı erlenmayer ölçeğinde standart Pichia gelişim koşulları altında (28 °C sıcaklık, pH 6.0) protein ekspresyonu çalışması yapılmış ve protein ürettiği SDS-PAGE ile doğrulanan klon ile çalışmaya devam edilmiştir. Düşük sıcaklığın MTGaz proteininin üretiminde uygun olduğu daha önce ekibimiz tarafından yapılan çalışmada belirlenmiştir. Bu yüzden sıcaklık 20°C'de sabit tutularak üç farklı pH (3.0, 5.0 and 7.0) değerinde üretim tekrarlanmıştır. Çalkalamalı erlenmayerde 96 saatlik protein ekspresyonu sonucunda en iyi üretim pH 7.0 değerinde elde edilmiş ve ulaşılan protein miktarı 396 ng/mL olarak hesaplanmıştır. Enzim aktivitesi ise pH 7.0 için 10200 U/mL olarak belirlenmiştir. Bu tez çalışması kapsamında Streptomyces mobaraensis MTGaz enzimi ilk kez P. pastoris'te ADH promotoru kontrolünde rekombinant olarak üretilmiştir. MTGaz enziminin üretiminde ADH promotorunun uygun bir promotor olduğu yapılan çalışma ile gösterilmiştir.

Özet (Çeviri)

While biotechnological developments are advancing rapidly, enzymes are produced and used in the food industry and many other fields for improving production, increasing efficiency and quality. Transglutaminase enzyme is an enzyme that has been used as a food additive in the field of biotechnology for a long time and can be synthesized by many organisms. Pichia pastoris expression system, a methylotrophic yeast, has been successfully used in the production of many recombinant proteins for both research and industrial purposes in recent years and is one of the most effective heterologous protein systems. In this study, extracellular expression of Streptomyces mobaraensis microbial transglutaminase (MTGase) enzyme was performed in P. pastoris under the control of alcohol dehidrogenase (ADH) promoter. For this purpose, firstly the pADH2α-proMTGase expression vector was constructed and transformed into P. pastoris KM71 strain. Protein expression study was performed with transformant Pichia clones selected on zeocin antibiotic agar plates under standard Pichia growth conditions (28°C temperature, pH 6.0) in shake flask, and the study was continued with the protein producing clone which was confirmed by SDS-PAGE. It was determined in the previous study by our laboratory that low temperature is suitable for the production of MTGase protein. Therefore, the production was repeated under three different pHs (3.0, 5.0 and 7.0), while keeping the temperature constant at 20°C. As a result of 96 hours of protein expression in shake flask, the best production was obtained at pH 7.0 and the amount of protein reached was calculated as 396 ng/mL. The enzyme activity was determined as 10200 U/mL for pH 7.0. Within the scope of this thesis, the S. mobaraensis MTGase enzyme was produced recombinantly under the control of ADH promoter in P. pastoris for the first time. It has been shown by the study that the ADH is a suitable promoter for the production of the MTGase enzyme.

Benzer Tezler

  1. Biotechnological approaches to the phosphorus cycle: Recombinant phytase production in bacillus subtilis

    Fosfor döngüsüne biyoteknolojik yaklaşımlar: Bacillus subtilis'de rekombinant fitaz üretimi

    KAYA İŞLEYEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    BiyomühendislikYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ BAHAR SOĞUTMAZ ÖZDEMİR

  2. Identification of bacilysin producer cells during biofilm formation in Bacillus subtilis

    Bacillus subtilis'de olgunlaşmış biyofilm yapısında basilisin üreten hücrelerin belirlenmesi

    EZGİ KOMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  3. The regulatory mechanisms of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human eosinophils

    Matriks metalloproteinaz enzimlerinin ve doku inhibitörlerinin insan eozinofil hücrelerinde regülasyon mekanizmalarının incelenmesi

    ECE OYLUMLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI

  4. Bacıllus halodurans c-125 alkalin serin proteazının üretimi, karakterizasyonu ve deterjan katkı maddesi olarak kullanımının araştırılması

    Production and characterization of bacillus halodurans c-125 alkaline serine protease and investigation of using as detergent additive

    AŞKIN TEKİN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KAZIM SEZEN

  5. Bacillus subtilis GntR ailesine ait LutR transkripsiyon faktörünün doğrudan kontrolü altındaki genlerin CHIP ve EMSA yöntemleriyle belirlenmesi

    Determination of genes under the direct control of GntR-type transcriptional factor LutR in Bacillus subtilis PY79 by CHIP and EMSA methods

    MURAT KEMAL AVCI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ