Extracellular production of recombinant microbial transglutaminase enzyme in Pichia pastoris
Rekombinant mikrobiyal transglutaminaz enziminin Pichia pastoris'te hücre dışı üretimi
- Tez No: 847253
- Danışmanlar: DOÇ. DR. AYSUN ÖZÇELİK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Biyoteknolojik gelişmeler hızla ilerlerken, enzimler gıda sektöründe ve diğer pek çok alanda üretimin iyileştirilmesi, verimlilik ve kalite artışı için kullanılmaktadır. Transglutaminaz enzimi uzun zamandır biyoloteknoloji alanında gıda katkı maddesi olarak kullanılan ve pek çok organizma tarafından sentezlenebilen bir enzimdir. Metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris (P. pastoris) ekspresyon sistemi, son yıllarda birçok rekombinant proteinin üretiminde hem araştırma hem de endüstriyel amaçlarla başarıyla kullanılmaktadır ve en etkili heterolog protein ekspresyon sistemlerinden biridir. Bu çalışmada, Streptomyces mobaraensis mikrobiyal transglutaminaz (MTGaz) enziminin P. pastoris'te alkol dehidrojenaz (ADH) promotoru kontrolünde hücre dışı ekspresyonu yapılmıştır. Bu amaçla, öncelikle pADH2α-proMTGase ekspresyon vektörü oluşturulmuş ve P. pastoris KM71 suşuna transforme edilmiştir. Zeosin antibiyotikli agar plakalarda seçilen transformant Pichia klonları ile çalkalamalı erlenmayer ölçeğinde standart Pichia gelişim koşulları altında (28 °C sıcaklık, pH 6.0) protein ekspresyonu çalışması yapılmış ve protein ürettiği SDS-PAGE ile doğrulanan klon ile çalışmaya devam edilmiştir. Düşük sıcaklığın MTGaz proteininin üretiminde uygun olduğu daha önce ekibimiz tarafından yapılan çalışmada belirlenmiştir. Bu yüzden sıcaklık 20°C'de sabit tutularak üç farklı pH (3.0, 5.0 and 7.0) değerinde üretim tekrarlanmıştır. Çalkalamalı erlenmayerde 96 saatlik protein ekspresyonu sonucunda en iyi üretim pH 7.0 değerinde elde edilmiş ve ulaşılan protein miktarı 396 ng/mL olarak hesaplanmıştır. Enzim aktivitesi ise pH 7.0 için 10200 U/mL olarak belirlenmiştir. Bu tez çalışması kapsamında Streptomyces mobaraensis MTGaz enzimi ilk kez P. pastoris'te ADH promotoru kontrolünde rekombinant olarak üretilmiştir. MTGaz enziminin üretiminde ADH promotorunun uygun bir promotor olduğu yapılan çalışma ile gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
While biotechnological developments are advancing rapidly, enzymes are produced and used in the food industry and many other fields for improving production, increasing efficiency and quality. Transglutaminase enzyme is an enzyme that has been used as a food additive in the field of biotechnology for a long time and can be synthesized by many organisms. Pichia pastoris expression system, a methylotrophic yeast, has been successfully used in the production of many recombinant proteins for both research and industrial purposes in recent years and is one of the most effective heterologous protein systems. In this study, extracellular expression of Streptomyces mobaraensis microbial transglutaminase (MTGase) enzyme was performed in P. pastoris under the control of alcohol dehidrogenase (ADH) promoter. For this purpose, firstly the pADH2α-proMTGase expression vector was constructed and transformed into P. pastoris KM71 strain. Protein expression study was performed with transformant Pichia clones selected on zeocin antibiotic agar plates under standard Pichia growth conditions (28°C temperature, pH 6.0) in shake flask, and the study was continued with the protein producing clone which was confirmed by SDS-PAGE. It was determined in the previous study by our laboratory that low temperature is suitable for the production of MTGase protein. Therefore, the production was repeated under three different pHs (3.0, 5.0 and 7.0), while keeping the temperature constant at 20°C. As a result of 96 hours of protein expression in shake flask, the best production was obtained at pH 7.0 and the amount of protein reached was calculated as 396 ng/mL. The enzyme activity was determined as 10200 U/mL for pH 7.0. Within the scope of this thesis, the S. mobaraensis MTGase enzyme was produced recombinantly under the control of ADH promoter in P. pastoris for the first time. It has been shown by the study that the ADH is a suitable promoter for the production of the MTGase enzyme.
Benzer Tezler
- Kobay aortasındaki prostasiklin sentezine amilorid ve analoglarının etkisi
Başlık çevirisi yok
AYDIN AKSOY
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1987
Endokrinoloji ve Metabolizma HastalıklarıGazi Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
- Grup teknolojisi imalat sistemi ve bu sistemin tasarımına yönelik yeni bir metot
Group technology manufacturing systems and a new method oriented to the design of these systems
M. BÜLENT DURMUŞOĞLU
- Hücre dışı Na+ iyonu konsantrasyonundaki değişimin gastrocnemius kasının yorulma durumu üzerindeki etkisinin incelenmesi
Başlık çevirisi yok
SABİHA AKSAY
- Hemoperfüzyon: Adsorpsiyon kolonu tasarımı
Başlık çevirisi yok
EYÜP ERTÜRK
Doktora
Türkçe
1987
Kimya MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ERHAN PİŞKİN
