Development of bacteriophage nanoparticles for glycomics analysis by genetic engineering
Glikomiks analizine yönelik bakteriyofaj nanopartiküllerinin genetik mühendisliği ile geliştirilmesi
- Tez No: 379637
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. EDA ÇELİK AKDUR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Genetik, Bioengineering, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2014
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 101
Özet
Kompleks karbonhidratlar (glikanlar) glikozilasyon prosesi sonucunda lipid ve proteinlere bağlanırlar ve hücre-hücre tanıması, metabolik alışveriş, patojen-konakçı ilişkisi de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte önemli roller oynarlar. Değişim geçiren glikozilasyonun, kanser ve retroviral enfeksiyonlar gibi hastalıkların nedeni olduğu bilinmektedir. Karbonhidrat tabanlı dizinler (arrays), ya da“glikodizinler,”glikomiks çalışmalarında güçlü bir araç olarak son on yılda ortaya çıkmıştır. Ancak bu dizinlerin potansiyelini arttırmak için, glikanların çeşitliliğini arttırmak ve katı destek üzerine karbonhidrat problarının immobilizasyonunu güvenilir ve tekrarlanabilir olacak şekilde geliştirmek gerekli olacaktır. Yakın zamanda, Campylobacter jejuni bakterisinde keşfedilen protein glikozilasyon gen bölgesi (Pgl), Escherichia coli bakterisine aktarılarak, bu bakteriye proteinleri glikozilleme yeteneği kazandırmıştır. Ayrıca, araştırma grubumuz, glikozilasyon genini taşıyan E. coli'yi enfekte eden, ve bir“alıcı proteini”taşıyan M13 bakteriyofaj parçacıklarının N-glikozillenebildiğini göstermiştir. Faj desenli mikrodizinlerin proteomik çalışmalarında artık kabul görmüş bir metod olduğu göz önüne alındığında, gelecekte GlikoFaj parçacıklarının mikrodizin kütüphanelerine eklenerek patojenlerin ve kanser teşhisinde kullanılması mümkün olacaktır. Bu çalışmada, konak hücre mühendisliği ve altı yeni bisistronik fajmid tasarımı ve üretimi planlanmış (pBAD-MBPDQNAT-g3p::PglB, pBAD-MBPDQNAT-g3p::PglBmut, pBAD-MBP4xAQNAT-g3p::PglB, pBAD-MBP4xDQNAT-g3p::PglBmut, pBAD-MBP4xDQNAT-g3ptr::PglB, pBAD-MBP4xDQNAT-g3ptr::PglBmut) ve tasarlanan fajmidlerin üretimi standart genetik mühendisliği teknikleri ile gerçekleştirilmiştir. Üretilen fajmidlerin restriksiyon enzimleri ile kesildikten sonra jel elektroforezinde boyut kontrolü ve ayrıca DNA dizin analizi ile doğrulaması yapılmıştır. Hücre içi glikan havuzunun arttırılarak faj parçacıklarının glikozillenme potensiyelinin arttırılması için, E. coli TG1 konak hücresinde bulunan waaL geninin silinmesi flüoresan aktif hücre ayırma (FACS) analizi ile doğrulanmıştır. Ardından glikofaj üretim kapasitesi ve faj stabilitesini arttırabilmek için farklı parametreler test edilmiş; (i) fajmidde kodlanan kısaltılmış-g3p, normal-g3p ile kıyaslandığında, glikanların faj üzerindeki gösteriminin daha etkin ve stabil olduğu saptanmış; (ii) daha spesifik sinyaller alabilmek için farklı saflaştırma koşulları araştırılarak, sarkosyl ile muamele edilen örneklerden daha yüksek anti-glikan sinyali alındığı görülmüş; (iii) indükleme koşullarının hücre çoğalması ve faj üretimindeki etkisini kıyaslamak için dokuz farklı parametre sınanmış; OD600=0.6 hücre derişiminde, 8x109 cfu/mL hacminde yardımcı faj ile enfekte edilen hücrelerden ve 16 saatlik indükleme sonrasında en yüksek glikofaj derişimi elde edilmiştir. Son olarak glikomik analizlemede yeni bir yöntem olan“glikofaj-ELISA metodu”ilk kez geliştirilmiştir. Dolaylı-ELISA metodu en uygun ELISA çeşidi seçilmiş; sınanan farklı bloklama tamponlarından %2 BSA-PBS (bovin serum albümin) tamponu ile anti-glikan antikoru ile daha spesifik bir sinyal elde edilmiştir. Bu çalışma, karbonhidrat temelli olmayan, basitleştirilmiş ve evrensel bir glikan saflaştırma tekniği sunması; nispeten daha ekonomik ve kararlı bir glikan temsil metodu olması sebepleriyle önem taşımaktadır. Farklı glikozilasyon yolaklarını kodlayan yeni plazmidlerin geliştirilmesiyle, glikofajların çeşitliliği gelecekte arttırılabilir. Sonuç olarak, bu çalışmada tanımlanan“glikofaj dizin teknolojisi”, glikan kütüphanelerinin genişletilmesine fayda sağlayacağı gibi, glikan-protein etkileşimlerinin yüksek-verimli analizinde kullanılan ekipmanların geliştirilmesinde tamamlayıcı bir özellik gösterecektir.
Özet (Çeviri)
Complex carbohydrates (glycans) are attached to proteins and lipids by the process of glycosylation and play important roles in many biological processes. Altered glycosylation is known to cause diseases including cancer and retroviral infection. Carbohydratebased arrays, or“glycoarrays,”have emerged in the last decade as a powerful tool in glycomics, especially in glycosylation-based diagnosis of diseases; however, to fully exploit the potential of glycans arrays, it is necessary to increase the diversity of glycans and to develop reliable and reproducible chemistries for immobilization of the carbohydrate probes onto solid support. Recently, the protein glycosylation locus (Pgl) discovered in Campylobacter jejuni was functionally transferred to Escherichia coli, conferring ability to glycosylate proteins. Additionally, our research group has recently demonstrated for the first time, N-glycosylation of phage particles (glycophages), simply by infecting the glycosylation competent E. coli with M13 phage displaying a glycan-acceptor protein. Considering that phage-patterned microarrays are a standard art in proteomics, the hypothesis of this study is that the glycophage particles can be exploited for the development of“glycophage arrays”, to be used in pathogen or cancer diagnosis in the future. In this study, host cell engineering and six new bicistronic phagemids construction and design were planned (pBAD-MBPDQNAT-g3p::PglB, pBAD-MBPDQNAT-g3p::PglBmut, pBAD-MBP4xAQNAT-g3p::PglB, pBAD-MBP4xDQNAT-g3p::PglBmut, pBAD-MBP4xDQNAT-g3ptr::PglB, pBAD-MBP4xDQNAT-g3ptr::PglBmut), and the designed phagemids were constructed using standard genetic engineering techniques. The sequence of the constructed phagemids were confirmed with restriction digestion and DNA sequencing analysis. Next, because glycosylation potential of phage particles are increased if the waaL gene is deleted from E. coli TG1 host cell, the deletion of waaL gene was verified with flourescence-activated cell sorting (FACS) analysis. Thereafter, in order to increase the glycophage production efficiency and stability of phagemids, different parameters were tested; and (i) the truncated-g3p in the phagemid enabled better display of glycans on the phage compared to full-length g3p, (ii) different purification conditions were tested to get spesific signals and the higher anti-glycan signal was obtained from sarkosyl treated samples, (iii) effect of induction conditions on cell growth and phage production capacity were compared with nine different parameters and best results were detected in the case where, OD600=0.6 at the time of infection, 8x109 CFU/mL of helper phage is used for infection and induction period is 16 h. Finally,“glycophage-ELISA”method was developed for the first time, as a new tool in glycomics analysis. Indirect ELISA method was choosen as the suitable ELISA type; and %2 BSA-PBS (bovine serum albumine) buffer gave a more specific anti-glycan signal compared to other blocking buffers tested. The study is significant because it has overcome the current bottlenecks in glycan array construction and provide a relatively inexpensive, specific and stable glycan representation method, as well as introduce a simplified and universal purification technique that is not dependent on the carbohydrate. With the development of new glycosylation pathway encoding plasmids, the variety of glycophages can be extended in the future. The basis of glycophage array technology described here should help to expand the diversity of glycan libraries and provide a complement to the existing toolkit for high-throughput analysis of glycan–protein interactions.
Benzer Tezler
- Escherichia coli ve Salmonella enteritidis tayinine yönelik yatay akış analiz sistemi geliştirilmesi
Development of lateral flow analysis system for the determination of Escherichia coli and Salmonella enteritidis
HASAN İLHAN
Doktora
Türkçe
2019
BiyokimyaHacettepe ÜniversitesiNanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NECDET SAĞLAM
- Development of lithium-oxygen battery nanostructured electrodes facilitated by M13 virus and plant extract
Lityum-oksijen piller için nano yapılı elektrotların M13 virüs ve bitki özleri ile üretimi
SARA PAKSERESHT
Doktora
İngilizce
2021
EnerjiSakarya ÜniversitesiNanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HATEM AKBULUT
- Sularda fekal kirlilik tayinine yönelik biyosensör geliştirilmesi
Biosensor development for the detection of faecal pollution in water
ÖZGECAN ERDEM
Doktora
Türkçe
2019
BiyoteknolojiHacettepe ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NİLÜFER CİHANGİR
PROF. DR. ADİL DENİZLİ
- Deneysel olarak metisilin dirençli staphylococcus aureus (MRSA) etkeni kullanılarak spondilodiskit modeli oluşturulan ratlarda bakteriyofaj ve antibiyotik tedavilerinin etkileri
Effects of bacteriophage and antibiotic treatments in rats with experimental spondylodiscitis model created by MRSA
HÜSEYİN EMRE KARACA
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2021
Ortopedi ve TravmatolojiAydın Adnan Menderes ÜniversitesiOrtopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUTLU ÇOBANOĞLU
- Engineering of bacteriophage M13 binding to inorganic surfaces as phage display ligands
İnorganik yüzeylere bağlanabilen bakteriyofajların faj gösterim ligandı olarak geliştirilmesi
ESMA AYBAKAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
BiyoteknolojiAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar ÜniversitesiMedikal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ERKAN MOZİOĞLU
PROF. DR. ZÜHTÜ TANIL KOCAGÖZ