Geri Dön

CRISPR-Cas9 based investigation of chromatin modifiers in human somatic cell reprogramming

CRISPR-Cas9 aracılığı ile kromatin modifiye eden genlerin insan hücre yeniden programlanmasında incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 435866
  2. Yazar: CAN AZTEKİN
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Moleküler Tıp, Molecular Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2016
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Koç Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomedikal Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 145

Özet

Somatik hücrelerin Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc transkripsiyon faktörleri ile pluripotensiye yeniden programlanması, epigenomun kromatin modifiye edenler aracılığıyla yeniden biçimlenmesiyle gerçekleşir. Bu bağlamda çalışılan genlerin bazıları yeniden programlamanın bariyer ve gerekli genleri olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte gelişen protokollerle yapılan geniş kapsamlı çalışmaları, yeniden programlanmanın beraberinde gelen shRNA verktörlerinin susturulmaya duyarlılığı ve bu genlerin knockout olduğu insan hücre hatlarının bulunmaması sınırlandırıyor. Böylece, yeniden programlanmanın farklı evrelerinde bu genlerin kalıcı modifikasyonuyla CRISPR-Cas9 knockout kütüphanesi kullanarak kromatin modifiye edenlerin sistematik incelenmesi hipotezini belirledik. Bu amaçla, 247 histon ve DNA modifiye eden kromatin yeniden düzenleyiciler, yazıcılar, okuyucular ve siliciler içeren kromatin modifiye edenlerin CRISPR-Cas9 kütüphanesi oluşturuldu. Ardından bu kütüphane, heterojen hücre popülasyonu oluşturulması ve sonrasında OSKM ile yeniden programlanmaya tabi tutulmasında kullanıldı.Bunun için, FACS aracılığıyla ayrıştırılmış Tra-1-60 pozitif ve retroviral yolla eksojen olarak üretilen yeşil floresan proteinleri (EGFP) susturulmuş hücrelerden elde edilen uPKH'lerden farklı zaman aralıklarında toplanılanlar kullanıldı. İzole edilen hücrelerde CRISPR rehber RNA'ların miktarı ileri nesil sekanslama yöntemi ile belirlendi. Spesifik rehber RNA'ların çokluğunun analizi, önceden çalışılmış ve ispatlanan somatik hücrelerin yeniden programlanmasının düzenleyicilerini doğruladı ve farklı dönemlere özgü yeni bariyer ve gerekli düzenleyiciler saptandı. Bunlardan PAXIP1, BRD2 ve USP22 bariyer ve CHAF1A, KDM8 ve PRMT5 gerekli düzenleyiciler olarak belirlendi. Üstelik gen kümelerinin işleve dayalı analizi, MLL komplekslerinin yeniden programlanmanın muhtemel bariyeri, BAF, SWI/SNF ve MOZ/MORF komplekslerinin de önemli düzenleyiciler olarak görev aldıklarını açıkladı. Tarama sonuçlarına dayanarak, farklı dönemlere özgü inhibitörlerin kombinasyonlarının kullanılmasının, yeniden programlanmayı hızlı ve daha verimli hale getirdiği görüldü. Bu çalışma yeniden programlamanın kromatin bazlı engellerinin açıklanmasına ve daha verimli yeniden programlama yolları için rehber olacaktır.

Özet (Çeviri)

Reprogramming of somatic cells to pluripotency via four transcription factors, Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (OSKM) involves extensive remodeling of the epigenome which is carried out by a number of chromatin modifiers. A number of these genes have been studied in the context of reprogramming and defined as barriers or essential regulators of this process. However, established protocols limit a comprehensive examination due to the susceptibility of shRNA vectors to proviral silencing which accompanies reprogramming, and the unavailability of human knock-out cell lines. Therefore, we hypothesized that pooled CRISPR-Cas9 knock-out libraries can enable systematic investigation of chromatin modifiers and reveal their role in different steps of reprogramming by enabling permanent gene modifications. To this end, we constructed a CRISPR-Cas9 knock-out library targeting the 247 chromatin modifiers including chromatin remodelers, writers, readers and erasers of histone and DNA modifications. We utilized this library to generate heterogeneous cell populations harboring putative chromatin modifier knock-outs, which were then reprogrammed with the delivery of OSKM. FACS-based enrichment of TRA-1-60 positive cells, and low copy exogenous retroviral EGFP silencing was utilized to collect emerging iPSCs at different time points of reprogramming. The abundance of CRISPR guide RNAs in isolated cells were determined by next generation sequencing. Analysis of relative enrichment of specific guide RNAs confirmed the majority of the known reprogramming regulators and identified novel stage specific barriers and essential regulators for human somatic cell reprogramming. These include PAXIP1, BRD2 and USP22 as barriers, and CHAF1A, KDM8 and PRMT5 as essential regulators. In addition, functional analysis based on class of genes revealed that various MLL complexes act as barriers, and BAD, SWI/SNF, and MOZ/MORF complexes act as essential regulators for reprogramming. Based on the screen results, stage specific combinatorial use of small molecule inhibitors enabled accelerated and more synchronous efficient reprogramming. Taken together this study establishes roadblocks of reprogramming through chromatin landscape, and can guide more efficient reprogramming strategies to be formulated.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    884195

    Generation of CRISPR/Cas9-based disease models and investigation of the molecular mechanisms of regeneration in zebrafish

    CRISPR/Cas9 tabanlı hastalık modellerinin üretilmesi ve zebra balıklarında rejenerasyonun moleküler mekanizmalarının araştırılması

    RAMAZAN UĞUR BORA

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    BiyolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    Genom Bilimleri ve Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ ÖZHAN

  2. Tez No

    753235

    Investigation of the effects of 2-hydroxyglutarate oncometabolite on colon cancer metabolism on cell models generated by CRISPR/Cas9-based gene therapy and in vivo models

    2-Hidroksiglutarat Onkometabolitinin Kolon Kanseri Metabolizması Üzerindeki Etkisinin CRISPR/Cas9-Tabanlı Gen Terapisi ile Oluşturulan Hücre Modelleri ve In Vivo Modeller Üzerinde İncelenmesi

    ESRA BULUT ATALAY

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyokimyaDokuz Eylül Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HÜLYA AYAR KAYALI

    DOÇ. DR. ŞERİF ŞENTÜRK

  3. Tez No

    758665

    VEGF-CRISPR/Cas9 plasmidi taşıyan kitozan nanoplekslerinin sıçan meme tümörü modelinde terapötik etkinliğinin araştırılması

    Investigation of the therapeutic efficacy of chitosan nanoplexes delivering VEGF-CRISPR-Cas9 plasmid in a rat mammary tumor model

    TUBA ÇANAK İPEK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiMarmara Üniversitesi

    Farmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SUNA ÖZBAŞ

  4. Tez No

    672486

    COX-2 Geninin CRISPR/Cas9 aracılı düzenlenmesi için polimerik nanopartikül temelli transfeksiyon ajanının kullanılabilirliğinin araştırılması

    Investigation of the usability of polymeric nanoparticle based transfection agent for CRISPR/CAS9-mediated editing of COX-2 gene

    RİZVAN İMAMOĞLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSA GÖKÇE

    DOÇ. DR. MEHMET KORAY GÖK

  5. Tez No

    838378

    CRISPR/CAS9 kullanılarak sığır preimplantasyon embriyolarının trofektoderm farklılaşmasında CDX2 rolünün araştırılması

    Investigation of CDX2 role in trophectoderm differentiation of bovine preimplantation embryos by using CRİSPR/CASs9

    EMEL TÜTEN SEVİM

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KEMAL KARABAĞ

Geri Dön