Geri Dön

Üç boyutlu (3B) in vitro Parkinson hastalığı modelleri oluşturulması ve oluşturulan modellerin karakterizasyonu

Production and characterization of three-dimensional (3D) in vitro Parkinson's disease models

PDF İndir

  1. Tez No: 479561
  2. Yazar: ASLI AYBİKE DOĞAN
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. AYLİN ŞENDEMİR ÜRKMEZ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
  6. Anahtar Kelimeler: Parkinson's disease (PD), in vitro model, 3-dimensional (3B) cell culture
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ege Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 143

Özet

Bu tez çalışmasında Parkinson Hastalığı (PH)'nı taklit edebilecek, klinik öncesi in vitro çalışmaları hızlı ve in vivo'ya daha yakın mikroçevre koşullarında denenmesi için üç-boyutlu (3B) bir PH modeli tasarlanması ve üretimi hedeflenmiştir. Bu amaçla PC12 ve SH-SY5Y hücre hatlarının mikrodoku oluşturma yetileri karşılaştırılarak bu mikrodokular üzerinde 6-hidroksi dopamin (6-OHDA) ile oluşturulan 3B nörotoksik model karakterize edilmiştir. Hücreler mikrodoku oluşturma yetilerinin karşılaştırılması amacıyla 3D Petri Dish® tekniği kullanılarak oluşturulan agar kalıpların mikroçıkıntılarında farklı sayılarda ekilmiş ve oluşan mikrodoku büyüklükleri ters faz ışık mikroskobu ile gözlemlenmiştir. Daha sonra 2B ve 3B kültür koşullarında oluşturulan PC12 ve SH-SY5Y mikrodokularında 6-OHDA nörotoksininin etkin dozu hücre canlılığı (MTT) testi ile belirlenmiş ve mikrodokular üzerinde sitotoksisite (LDH) ve canlı&ölü hücre testi (Live&Dead) analizleri gerçekleştirilmiştir. Son olarak, 2B ve 3B kültür koşullarında oluşturulan PC12 ve SH-SY5Y PH modellerinde, Tirozin Hidroksilaz (TH), P maddesi (Substance P, SP), Vazoaktif İntestinal Peptit (VIP) ve Sinaptofizin (SYN) belirteçlerinin ifadeleri immünofloresan (İSK) ve immünohistokimyasal (İHK) analizler ile, Tirozin Hidroksilaz (TH), Dopamin Taşıyıcısı – 1 (DAT1), Parkin (PARK2) ve alfa-sinüklein (α-Syn) genlerinin ekspresyon oranları da kantitatif gerçek zamanlı polimerik zincir reaksiyonları (qRT-PCR) ile belirlenmiştir. Etkin dozu belirlenmiş 6-OHDA indüksiyonu sonrasında yapılan LDH analizi sonucunda, 2B ve 3B koşullarda kültive edilen PC12 hücrelerinde hücre membran bütünlüğü bozulmuşken, SH-SY5Y hücrelerinde hiçbir membran hasarı görülmemiş; 6-OHDA'nın PC12 hücrelerinde oluşturduğu toksisitenin, oluşan ROS miktarının artışı ve apoptotik yolağın aktive olmasının yanı sıra, membran bütünlüğünün bozulmasından da kaynaklandığı ve PC12 hücrelerinin SH-SY5Y hücrelerine göre daha zayıf membran özelliklerine sahip oldukları belirlenmiştir. Ayrıca, 3B kültür koşullarında PC12 hücrelerinin 2B koşullara göre membran bütünlüklerini daha çok korudukları belirlenmiştir. Yapılan canlı&ölü analizinde, 6-OHDA indüksiyonuyla birlikte her iki modelde de hücre canlılığında düşüş gözlemlenmiş olup, ölü hücrelerin düşük adhesif özellikleri nedeniyle, mikrodokudan uzaklaşma eğilimde oldukları belirlenmiştir. Dopaminerjik nöron belirteçlerinin ekspresyonlarının incelenmesi için uygulanan İSK/İHK analizlerinin sonucunda, 2B ve 3B SH-SY5Y deney gruplarında TH, VIP ve SP belirteçlerinin ekspresyonunun kontrol gruplarına göre daha az, SYN belirtecinin ekspresyonunun ise tam tersi şekilde daha fazla gözlenmesi, 3B kültür koşullarındaki hücrelerin birbirleriyle olan etkileşimlerinin 2B kültür koşullarına göre daha yüksek olmasından ve 6-OHDA nöroroksisitesiyle birlikte hücrelerde oluşan strese karşı, birbirleriyle olan etkileşimlerini arttırabilmek adına sinaptik faaliyetlerini arttırmalarından kaynaklandığı sonucuna varılmıştır. 3B PC12 modelinde de, mikrodoku kesitleri alınması sırasında mikrodokular dağılmış olduğundan, TH, VIP, SP ve SYN belirteçlerinin tümünün eksprese olduğu tespit edilmesine rağmen karşılaştırılamamıştır. Gerçekleştirilen kantitatif gerçek zamanlı polimerik zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi karşılaştırıldığında, 2B PH modellerinde 6-OHDA toksisitesinin deney gruplarında TH ve PARK2 gen ekspresyonlarında konrol grubuna göre azalışa neden olurken, α-Syn geninde artışa neden olduğu, DAT1 geninin ise SH-SY5Y hücrelerinde az da olsa eksprese olurken, PC12 hücrelerinde eksprese edilmediği gözlemlenmiştir. 3B kültür koşullarında ekspresyon seviyeleri incelendiğinde, SH-SY5Y hücrelerinde incelenen genlerde ekspresyon gözlemlenmesine rağmen, PC12 mikrodokularının kontrol gruplarında dahi DAT1 ve α-Syn genleri eksprese edilmemiş, kontrol grubunda az da olsa eksprese olan PARK2 geni, 6-OHDA uygulaması sonrasında eksprese edilmemiştir. 2B kontrol gruplarında ekspresyon görülürken 3B kontrol gruplarında bazı genlerin ekspresyonunun gözlemlenememesi, PC12 hücrelerinin 2B kültür koşullarında kısmen sergiledikleri dopaminerjik nöron özelliklerini, 3B kültür koşullarında neredeyse tamamen kaybettiğinin bir kanıtı niteliğindedir. 3B PH modelleri karşılaştırılmasıdan elde edilen tüm verilerin sonucunda, SH-SY5Y mikrodokularının 6-OHDA toksisitesi-indüklü PH modeli olarak kullanılabileceği ve PH'nın teşhis ve tedavisine yönelik çalışmalarda 2B in vitro ile in vivo çalışmaları arasındaki boşluğu doldurabilecek alternatif bir model olabileceği gösterilmiştir.

Özet (Çeviri)

In this thesis, a three-dimensional (3D) in vitro Parkinson's Disease (PD) model was designed and produced in order to test pre-clinical in vitro studies rapidly and simulating in vivo microenvironment conditions closer. For this purpose, we compared the ability of PC12 and SH-SY5Y cell lines' microtissue forming abilities and characterized the 3D neurotoxic model formed by 6-hydroxy dopamine (6-OHDA) toxicity on these microtissues. Cells were seeded at different numbers in the microtextures of agar plates formed using the 3D Petri Dish® technique to compare microdissection capabilities and the resulting microtissue sizes were observed with inverted phase contrast light microscopy. Effective doses of 6-OHDA neurotoxin were determined by MTT assay in 2D and 3D culture conditions for both PC12 and SH-SY5Y cells. Live & dead cell analyses were performed for 3D models and cytotoxicity (LDH) analyses were performed on both 2D and 3D PD models. The expression of tyrosine hydroxylase (TH), substance P (Substance P, SP), vasoactive intestinal peptide (VIP) and synaptophysin (SYN) markers in the PC12 and SH-SY5Y PD models generated in 2D and 3D culture conditions were evaluated by immunocytochemical (ICC) and immunohistochemical (IHC) staining. Finally, the expression ratios of Tyrosine Hydroxylase (TH), Dopamine Transporter-1 (DAT1), Parkin (PARK2) and alpha-synuclein (α-Syn) genes were identified by real-time quantitative polymeric chain reactions (qRT-PCR). As a result of LDH analysis after induction of 6-OHDA with active doses, no cell membrane damage was observed in SH-SY5Y cells, while PC12 cells' membrane integrity deteriorated in both 2D and 3D culture conditions. It has been observed that the toxicity of 6-OHDA on PC12 cells was due to the increased amount of ROS produced and the activation of the apoptotic pathway as well as the deterioration of membrane integrity. Thus, we have determined that PC12 cells have weaker membrane properties than SH-SY5Y cells. In addition, it has been identified that PC12 cells in 3D culture conditions are more likely to protect membrane integrity compared to 2D conditions. It was determined that the dead cells tend to move away from microtissues due to their low cohesive properties after 6-OHDA induction. In both 2D and 3D SH-SY5Y experimental groups, the expression of TH, VIP and SP markers was lower than the control groups that did not receive 6-OHDA induction, while the expression of the SYN was higher in the 3D culture conditions than in the 2D culture conditions. This could be because of the tendencey of SH-SY5H cells' increased synaptic activity in order to increase their interactions after stress that was caused by induction with 6-OHDA. In the 3D PC12 model, it was not possible to compare the TH, VIP, SP and SYN markers because the microtissues were dispersed. qRT-PCR analysis in 2D models revealed that 6-OHDA caused a decline in expression of TH and PARK2 genes compared to the control group while causing an increase in expression of α-Syn gene. DAT1 gene was expressed slightly in SH-SY5Y cells, however PC12 cells didn't express DAT1 at all. Under 3D culture conditions, all studied genes' expressions were observed in SH-SY5Y cells, while PC12 microtissues did not show any expression of DAT1 and α-Syn, even in control groups, while PARK2 was only slightly expressed in the control group. However, following the 6-OHDA induction, PARK2 gene expression was lost. No expression of the control group of PC12 cells's certain genes in 3D conditions might be the proof that PC12 cells lost their dopaminergic properties completely in 3D conditions. As a result of all the data obtained from comparison of tested 3D PD models, it has been shown that SH-SY5Y microtissues can be used as a 6-OHDA toxicity-induced 3D in vitro PD model and can be an alternative model to fill the gap between 2D in vitro and in vivo studies in the diagnosis and treatment of PD.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    467634

    Development of peptide based materials as a synthetic scaffold to mimic extracellular matrix

    Hücreler arası matrisin taklit edilmesi için sentetik iskele olarak peptit tabanlı malzemelerin geliştirilmesi

    MELİKE SEVER

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyomühendislikİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Malzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. AYŞE BEGÜM TEKİNAY

  2. Tez No

    472986

    In situ cell death monitoring in 3D tissue cultures using surface enhanced Raman spectroscopy

    Yüzeyde zenginleştirilmiş Raman spektoroskopisi kullanılarak 3 boyutlu doku kültüründe hücre ölümünün yerinde izlenmesi

    MİNE ALTUNBEK

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyoteknolojiYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MUSTAFA ÇULHA

  3. Tez No

    882997

    Aktive trombositten zengin plazmanın testis organoidlerinde In Vitro spermatogeneze etkisi

    The effect of activated platelet rich plasma on In Vitro spermatogenesis in testis organoids

    MERVE BULUT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Histoloji ve EmbriyolojiTokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi

    Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ NİLGÜN YERSAL

  4. Tez No

    547281

    Adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin polietilenglikol dimetakrilat hidrojellerde kahverengi ve beyaz adipoz dokuya farklılaşmalarının incelenmesi

    Investigation of brown and white adipose tissue differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells on polyethyleneglycole dimethacrylate hydrogels

    ASLI SENA KARANFİL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyolojiHacettepe Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU

  5. Tez No

    835253

    Role of extracellular microenvironment on lung cancer cell metabolism

    Akciğer kanseri hücre metabolizması üzerinde hücre dışı mikroortamın rolü

    NURİYE SOLCAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    GenetikKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ECE ÖZTÜRK

Geri Dön