Geri Dön

NAD+ bağımlı Candida methylica format dehidrogenaz enziminin R258 ve H311 pozisyonlarının reaksiyon mekanizmasındaki rollerinin incelenmesi

Investigation of the role of R258 ve H311 positions of NAD+ dependent Candida methylica formate dehydrogenase on the reaction mechanism

PDF İndir

  1. Tez No: 492610
  2. Yazar: MELTEM ÇORBACIOĞLU
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Biyomühendislik, Biochemistry, Bioengineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 62

Özet

ÖZET Endüstride gerçekleştirilen enzimatik reaksiyonlarda ihtiyaç duyulan kofaktörlerin pahalı olmasından dolayı, reaksiyon ortamındaki kofaktörlerin yenilenmesinin önemi büyüktür. NAD + -bağımlı format dehidrogenazlar (EC 1.2.1.2) karbonil grubunun oksidasyonunu katalizleyerek ürün olarak CO 2 oluştururken, NAD + ' i, NADH' e indirgerler. Endüstride kullanımı yaygın olan NADH' in format dehidrogenaz enzimi kullanılarak yenilenmesi, kolay ve ucuz bir yöntemdir. Fakat bu enzimlerin aktivitesi endüstride kullanım için yeterli değildir. Bu çalışmada, Candida methylica format dehidrogenaz (CmFDH) enziminin R258 ve H311 pozisyonlarının reaksiyon mekanizmasındaki rollerinin incelenmesi hedeflenmektedir. CmFDH enziminin aktif bölgesinde bulunduğu düşünülen H311 ve R258 amino asit pozisyonlarına Tekrarlayan doyurulmuş mutasyon (ISM) - Kombine aktif bölge doyurulmuş test (CAST) yöntemi ile protein mühendisliği uygulanmıştır. CmFDH H311 ve R258 pozisyonları için dejeneratif kodon içeren primerler tasarlanarak, mutasyonlar gerçekleştirilmiştir. Otoindüksiyon-Studier besiyerinde E.Coli BL21 (DE3) hücrelerinde ifade edilmesi sağlanan, yabanıl tip ve mutant enzimler, Ni-NTA HisTrap kolonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Mutantların aktivite ve kinetik ölçümleri yapılarak yabanıl tip ile karşılaştırılmıştır. Format ve NAD + substrat olarak kullanılıp kararlı hal kinetik çalışmaları gerçekleştirilerek, Michaelis- Menten kinetik değerler hesaplanmıştır. Yaklaşık olarak R258 kütüphanesi için 200 koloni, H311 kütüphanesi için 70 koloni taranmıştır. R258S, H311S, H311C, H311Y mutant CmFDH' lar elde edilmiş ama bu mutasyonlarda formata karşı ölçülebilir bir aktivite görülmemiştir. Yabanıl tip CmFDH ile kıyaslandığında H311D mutant CmFDH' ın katalitik verimliliğinde artış görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlar, seçilen pozisyonların enzim aktivitesi için fonksiyonel amino asitler olduğunu göstermiştir. Seçilen pozisyonlarda yeni amino asitlerin, substrat ile olan etkileşiminin görülmesi ve enzimin aktivitesindeki rolünün daha detaylı anlaşılması için modelleme çalışmaları halen devam etmektedir.

Özet (Çeviri)

SUMMARY The regeneration of NADH in the reaction has great importance because the cofactor required by the enzymatic reactions carried out in the industry is very expensive. NAD + -dependent formate dehydrogenases (EC 1.2.1.2) catalyse the oxidation of formate anion into carbon dioxide, coupled with the reduction of NAD + to NADH. Regeneration of NADH using formate dehydrogenase is easy and inexpensive. However, the activity of these enzymes is not sufficient for industrial use. In this study, it is aimed to investigate of the role of R258 and H311 positions of Candida methylica formate dehydrogenase on the reaction mechanism by protein engineering. Mutagenesis for H311 and R258 aminoacid positions of CmFDH, which are thought to present in the active-site of the enzyme, was performed by the ISM-CAST method. Primers containing NRT degenerative codon was used for mutagenesis. Wild-type and mutant CmFDHs were expressed in E.Coli BL21 (DE3) cells in auto- induction Studier medium. Then the proteins were purified by using Ni-NTA HisTrap column. Activity and kinetic measurements of mutant CmFDHs were carried out and kinetic parameters were compared to the wild type CmFDH. Steady- state kinetic studies were performed against both formate and NAD + and Michaelis- Menten kinetic parameters were calculated. Approximately 200 colonies for the R258 library and 70 colonies for the H311 library were scanned. R258S, H311S, H311C, H311Y mutant CmFDHs were obtained, however these mutations did not show any measurable activity. When compared to wild-type CmFDH, the H311D mutant of CmFDH showed an increase in catalatic efficiency. These results show that selected positions are functional amino acids for enzyme activity. Modeling studies are still in progress to better understand the interaction of new amino acids with the substrate in selected positions and the role of these positions in enzyme activity.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    293881

    Protein engineering applications on candida methylica formate dehydrogenase to elucidate folding mechanisms and to increase the thermostability

    Protein mühendisliği ile candida methylica format dehidrogenaz enziminin katlanma mekanizmasının aydınlatılması ve termostabilitesinin arttırılması

    EMEL ORDU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  2. Tez No

    439698

    Increasing specific activity of NAD+-dependent Q105R mutant of candida methylica formate dehydrogenase

    NAD+-bağımlı mutant Q105R candida methylica fFormat dehidrogenazın spesifik aktivitesinin artırılması

    SONER TORUN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER

  3. Tez No

    310673

    Multifunctional formate dehydrogenase fusion protein binds to gold surface with improved reaction kinetics

    Altın yüzeye bağlanabilen çok yönlü format dehidrogenaz füzyon proteininin geliştirilmiş kinetik aktivitesi

    DENİZ TANIL YÜCESOY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN KARATAŞ

    PROF. DR. CANDAN TAMERLER

  4. Tez No

    335801

    Site-directed mutagenesis applications on target sites of cmFDH to improve thermostability

    cmFDH enziminin termostabilitesinin geliştirilmesine yönelik hedef bölgeler üzerinde bölgeye özel mutasyon uygulamaları

    MERT TAHMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    YRD. DOÇ. EMEL ORDU

  5. Tez No

    610371

    Protein engineering applications on industrially important enzymes

    Endüstriyel öneme sahip enzimlerin protein mühendisliği uygulamaları

    GÜLŞAH ÖZGÜN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

Geri Dön