NAD+ bağımlı Candida methylica format dehidrogenaz enziminin R258 ve H311 pozisyonlarının reaksiyon mekanizmasındaki rollerinin incelenmesi
Investigation of the role of R258 ve H311 positions of NAD+ dependent Candida methylica formate dehydrogenase on the reaction mechanism
- Tez No: 492610
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biyomühendislik, Biochemistry, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 62
Özet
ÖZET Endüstride gerçekleştirilen enzimatik reaksiyonlarda ihtiyaç duyulan kofaktörlerin pahalı olmasından dolayı, reaksiyon ortamındaki kofaktörlerin yenilenmesinin önemi büyüktür. NAD + -bağımlı format dehidrogenazlar (EC 1.2.1.2) karbonil grubunun oksidasyonunu katalizleyerek ürün olarak CO 2 oluştururken, NAD + ' i, NADH' e indirgerler. Endüstride kullanımı yaygın olan NADH' in format dehidrogenaz enzimi kullanılarak yenilenmesi, kolay ve ucuz bir yöntemdir. Fakat bu enzimlerin aktivitesi endüstride kullanım için yeterli değildir. Bu çalışmada, Candida methylica format dehidrogenaz (CmFDH) enziminin R258 ve H311 pozisyonlarının reaksiyon mekanizmasındaki rollerinin incelenmesi hedeflenmektedir. CmFDH enziminin aktif bölgesinde bulunduğu düşünülen H311 ve R258 amino asit pozisyonlarına Tekrarlayan doyurulmuş mutasyon (ISM) - Kombine aktif bölge doyurulmuş test (CAST) yöntemi ile protein mühendisliği uygulanmıştır. CmFDH H311 ve R258 pozisyonları için dejeneratif kodon içeren primerler tasarlanarak, mutasyonlar gerçekleştirilmiştir. Otoindüksiyon-Studier besiyerinde E.Coli BL21 (DE3) hücrelerinde ifade edilmesi sağlanan, yabanıl tip ve mutant enzimler, Ni-NTA HisTrap kolonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Mutantların aktivite ve kinetik ölçümleri yapılarak yabanıl tip ile karşılaştırılmıştır. Format ve NAD + substrat olarak kullanılıp kararlı hal kinetik çalışmaları gerçekleştirilerek, Michaelis- Menten kinetik değerler hesaplanmıştır. Yaklaşık olarak R258 kütüphanesi için 200 koloni, H311 kütüphanesi için 70 koloni taranmıştır. R258S, H311S, H311C, H311Y mutant CmFDH' lar elde edilmiş ama bu mutasyonlarda formata karşı ölçülebilir bir aktivite görülmemiştir. Yabanıl tip CmFDH ile kıyaslandığında H311D mutant CmFDH' ın katalitik verimliliğinde artış görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlar, seçilen pozisyonların enzim aktivitesi için fonksiyonel amino asitler olduğunu göstermiştir. Seçilen pozisyonlarda yeni amino asitlerin, substrat ile olan etkileşiminin görülmesi ve enzimin aktivitesindeki rolünün daha detaylı anlaşılması için modelleme çalışmaları halen devam etmektedir.
Özet (Çeviri)
SUMMARY The regeneration of NADH in the reaction has great importance because the cofactor required by the enzymatic reactions carried out in the industry is very expensive. NAD + -dependent formate dehydrogenases (EC 1.2.1.2) catalyse the oxidation of formate anion into carbon dioxide, coupled with the reduction of NAD + to NADH. Regeneration of NADH using formate dehydrogenase is easy and inexpensive. However, the activity of these enzymes is not sufficient for industrial use. In this study, it is aimed to investigate of the role of R258 and H311 positions of Candida methylica formate dehydrogenase on the reaction mechanism by protein engineering. Mutagenesis for H311 and R258 aminoacid positions of CmFDH, which are thought to present in the active-site of the enzyme, was performed by the ISM-CAST method. Primers containing NRT degenerative codon was used for mutagenesis. Wild-type and mutant CmFDHs were expressed in E.Coli BL21 (DE3) cells in auto- induction Studier medium. Then the proteins were purified by using Ni-NTA HisTrap column. Activity and kinetic measurements of mutant CmFDHs were carried out and kinetic parameters were compared to the wild type CmFDH. Steady- state kinetic studies were performed against both formate and NAD + and Michaelis- Menten kinetic parameters were calculated. Approximately 200 colonies for the R258 library and 70 colonies for the H311 library were scanned. R258S, H311S, H311C, H311Y mutant CmFDHs were obtained, however these mutations did not show any measurable activity. When compared to wild-type CmFDH, the H311D mutant of CmFDH showed an increase in catalatic efficiency. These results show that selected positions are functional amino acids for enzyme activity. Modeling studies are still in progress to better understand the interaction of new amino acids with the substrate in selected positions and the role of these positions in enzyme activity.
Benzer Tezler
- Protein engineering applications on candida methylica formate dehydrogenase to elucidate folding mechanisms and to increase the thermostability
Protein mühendisliği ile candida methylica format dehidrogenaz enziminin katlanma mekanizmasının aydınlatılması ve termostabilitesinin arttırılması
EMEL ORDU
Doktora
İngilizce
2010
Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Increasing specific activity of NAD+-dependent Q105R mutant of candida methylica formate dehydrogenase
NAD+-bağımlı mutant Q105R candida methylica fFormat dehidrogenazın spesifik aktivitesinin artırılması
SONER TORUN
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER
- Multifunctional formate dehydrogenase fusion protein binds to gold surface with improved reaction kinetics
Altın yüzeye bağlanabilen çok yönlü format dehidrogenaz füzyon proteininin geliştirilmiş kinetik aktivitesi
DENİZ TANIL YÜCESOY
Yüksek Lisans
İngilizce
2011
Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYTEN KARATAŞ
PROF. DR. CANDAN TAMERLER
- Site-directed mutagenesis applications on target sites of cmFDH to improve thermostability
cmFDH enziminin termostabilitesinin geliştirilmesine yönelik hedef bölgeler üzerinde bölgeye özel mutasyon uygulamaları
MERT TAHMAZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
YRD. DOÇ. EMEL ORDU
- Protein engineering applications on industrially important enzymes
Endüstriyel öneme sahip enzimlerin protein mühendisliği uygulamaları
GÜLŞAH ÖZGÜN
Doktora
İngilizce
2019
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER