Geri Dön

Protein engineering applications on candida methylica formate dehydrogenase to elucidate folding mechanisms and to increase the thermostability

Protein mühendisliği ile candida methylica format dehidrogenaz enziminin katlanma mekanizmasının aydınlatılması ve termostabilitesinin arttırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 293881
  2. Yazar: EMEL ORDU
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2010
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 203

Özet

NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (EC 1.2.1.2, FDH) metilotrofik mikroorganizmalarda metanol metabolizmasındaki son enzimdir ve formatın karbondioksite oksidasyonunu katalizlerken NAD+'yi NADH'e indirger. Endüstriyel açıdan en önemli rolü NAD+ ve format kullanarak NADH'i rejenere etmesidir. Birçok avantajına rağmen düşük termostabilitesi FDH enzimin en önemli dezavantajıdır. Bu tez çalışması başlıca üç kısma ayrılmaktadır. Öncelikle protein mühendisliği çalışmalarında oluşturulacak mutant enzimlerin kolay ve verimli saflaştırılabilmesi amacıyla Candida methylica mayasından klonlanmış olan NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (cmFDH) enzimi için basit ve etkili bir protein saflaştırma metodu geliştirilmiştir. İkinci bölümde orjinal cmFDH enziminin katlanma mekanizması ve stabilitesi incelenmiştir. Protein dissosiayon sabitinin 10-13 M olarak hesaplandığı denge denaturasyon deneyleri cmFDH'in iki yapılı tek adım geçiş modeline göre katlanmamış hale geçtiğini göstermiştir. Kinetik deneyler sonucunda katlanma işleminin iki adımda gerçekleştiği gözlenmiştir. Fizyolojik koşullarda dimerik yapının dissosiasyon sabiti oldukça yavaştır (3x10-7 s-1). Son olarak, termostabiliteyi arttırmak amacıyla Pseudomonas sp. 101 ve Candida boidinii FDH'lerinin kristal yapıları temel alınarak hazırlanan cmFDH homolji modeli kullanılarak orjinal enzim üzerine protein mühendisliği stratejileri uygulanmıştır. Termodinamik ve kinetik sonuçlar dört mutasyonun, N187E, Q105R and N147R, M1C, orjinal cmFDH enziminin katlanma biçimini değiştirmeden stabiliteyi arttırdığını ortaya koymaktadır.

Özet (Çeviri)

NAD+-dependent formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2, FDH) is the last enzyme in the metabolism of methanol in methylotrophs and catalyzes the oxidation of formate anion into carbondioxide concomitant with the reduction of NAD+ to NADH. One crucial role of this enzyme in industrial redox chemistry is to regenerate NADH from NAD+ and formate. Although there are many advantages using FDH for this purpose, one problem is a lack of thermostability. The studies described in this thesis are divided into three parts. Initially, a simple and efficient molecular biological method was described to improve the purification of NAD+-dependent FDH from yeast Candida methylica (cmFDH). It allowed us to easily purify the constructed thermostabile mutants. The second section describes the folding mechanism and stability of dimeric native cmFDH. Equilibrium denaturation data yielded a dissociation constant of about 10-13 M. Findings showed that native cmFDH unfolds by two state single transition model in equilibrium. The kinetics of refolding and unfolding reactions revealed that the overall process comprises 2 steps. The rate of dissociation of the dimeric state in physiological conditions is extremely slow (k-2 ~ 3x10-7 s-1). Finally, protein engineering strategies were applied to increase the thermostability by using a homology model of cmFDH based on Pseudomonas sp. 101 and Candida boidinii. The thermodynamic and kinetic results suggested that four mutations, N187E, Q105R and N147R, M1C increased the stability while the folding and unfolding patterns of native cmFDH was not altered.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    610371

    Protein engineering applications on industrially important enzymes

    Endüstriyel öneme sahip enzimlerin protein mühendisliği uygulamaları

    GÜLŞAH ÖZGÜN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  2. Tez No

    445055

    Effect of silanization agent on the immobilization of lipase on a silica-based support material

    Silika bazlı taşıyıcıya lipaz immobilizasyonunda silanlama ajanının etkisi

    YASEMİN KAPTAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR

  3. Tez No

    465467

    CALB (Candida antarctica lipase B) immobilization on APTMS activated carrier via cross-linking method

    APTMS ile aktive edilmiş taşıyıcıya CALB'nin (Candida antarctica lipase B) çapraz bağlama yöntemi ile immobilizasyonu

    SALİH SÜHA AKAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR

  4. Tez No

    398071

    Immobilization of lipase on an inorganic support material and polycaprolactone synthesis

    Lipazın inorganik taşıyıcıda immobilizasyonu ve polikaprolakton sentezi

    CANSU ÜLKER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR

  5. Tez No

    330706

    Süperkritik akışkan ortamda lipazların taşıyıcısız enzim immobilizasyonu

    Lipase enzyme immobilization carrier of supercritical fluid environment

    HASAN APTİŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    BiyokimyaCumhuriyet Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. UĞUR SALGIN

Geri Dön