Inverse metabolic engineering and molecular characterization of resistance to phenolic compounds in Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae'de fenolik bileşiklere direncin tersine metabolik mühendisliği ve moleküler karakterizasyonu
- Tez No: 547652
- Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 112
Özet
Ulaşım sektörü ve kimya endüstrisi neredeyse tamamen petrol kaynaklarına bağımlıdır. Fakat, petrol rezervleri doğası gereği sınırlı olmakla birlikte yakın zaman içinde, tükenmemişse bile, yetersiz ve pahalı hale gelecektir. Alternatif olarak, yakıtların ve kimyasalların, mikrobiyal biyoteknoloji kullanılarak yenilenebilir kaynaklardan üretilmesi konusu endüstriyel ve bilimsel açıdan ilgi çekmektedir. Saccharomyces cerevisiae, ekmek ve alkollü içeceklerin üretimi gibi geleneksel kullanım alanlarının ötesinde, değerli kimyasalların üretimi için bir hücre fabrikası olarak kullanılabilir. Halihazırda, S. cerevisiae'nin biyoteknoloji uygulamalarındaki potansiyeli hem temel araştırmalar hem de endüstriyel uygulamalar ile kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, hedeflenen biyodönüşümleri daha verimli gerçekleştirebilmesi için, S. cerevisiae'nin çeşitli özelliklerinin iyileştirilmesi gerekmektedir. S. cerevisiae-temelli proseslerde kullanılacak monomer şekerler, şeker ve nişasta mahsullerine alternatif olarak, lignoselülozik biyokütle gibi yenilenebilir kaynaklardan elde edilebilir. Lignoselülozik biyokütle ucuz ve bol bulunan bir kaynaktır. Tarımsal atıklar, ahşap talaş atıkları, kâğıt endüstrisi atıkları ve orman kaynakları potansiyel biyokütle kaynaklarıdır. Lignoselüloz, yapısının karmaşıklığından dolayı, şeker bitkileri ve nişasta mahsullerinden farklı olarak, doğrudan fermantasyonda kullanıma uygun değildir ve monomer şekerlerin açığa çıkarılması için bir dizi işlem gereklidir. Öncelikle, önmuamele ile biyokütlenin fiziksel yapısı, takip eden hidroliz adımı için uygun hale getirilir. Enzimatik hidroliz sonrası fermente edilebilir şekerler açığa çıkar. Bu işlemler sırasında, monomer şekerlerin yanı sıra, S. cerevisiae gibi fermantasyonda kullanılan mikroorganizmaları inhibe eden bileşikler de yan ürün olarak oluşur. Lignoselülozun önmuamele adımında açığa çıkan bu inhibitörler, furanlar, organik asitler ve fenolikler olarak üç farklı grupta sınıflandırılır. Fenolikler kimyasal olarak çeşitlilik gösteren bir gruptur ve inhibisyon mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Fenolikler, S. cerevisiae'nin fermantasyon performansına olumsuz etki eder ve ürün veriminde düşüşe neden olur. S. cerevisiae, hidrolizatta bulunan bazı fenolik bileşikleri daha az toksik türevlerine dönüştürebilmektedir. Metabolik mühendislik yaklaşımları ile, S. cerevisiae'nin çeşitli stres koşullarına olan direnci geliştirilebilir. Bu yaklaşımlardan biri olan rasyonel metabolik mühendislik, bir metabolik sisteme, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak yapılan hesaplanmış genetik manipülasyonları içerir. Bu yaklaşımın başarısı metabolik sistem hakkında genetik ve biyokimyasal düzeyde detaylı bilgiye sahip olunmasına bağlıdır. Dolayısıyla, hakkında kısıtlı bilgiye sahip olunan veya stres direnci gibi kompleks bir moleküler altyapısı olan hücresel özelliklerin iyileştirilmesi amaçlandığında bu yaklaşım kısıtlı kalmaktadır. xxi Bailey tarafından 1996'da tanımlanan“tersine metabolik mühendislik”yaklaşımında, rasyonel mühendisliğin tersine, araştırmaya fenotip düzeyinde başlanır; öncelikle mevcut bir referans suşa göre gelişmiş özelliklere sahip mikrobiyal suşlar elde edilir. Hedeflenen özelliklere sahip bu suşlar doğadan, kültür koleksiyonlarından ya da evrimsel mühendislik ile laboratuvar ortamında izole edilebilir. Endüstri ve doğa koşullarının sıklıkla farklı oldukları göz önünde alındığında, endüstriyel açıdan önemli özelliklerin elde edilmesi hedeflediğinde evrimsel mühendislik avantajlı bir yaklaşımdır. Tersine metabolik mühendislik, hedef fenotipin genetik temeli ve/veya oluşmasında etkili olan çevresel faktörlerin belirlenmesini gerektirir. Bu noktada, omik teknolojilerdeki gelişmeler, biyolojik sistemlerin kapsamlı olarak incelenmesini ve belirli bir fenotip ile ilişkili moleküler altyapının anlaşılmasını kolaylaştırmıştır. Koniferil aldehit, hidrolizatlarda bulunan en toksik fenolik bileşiklerden biridir ve lignoselüloz hidrolizatlarında 1.7 mM'a kadar bulunabilir. Öte yandan, daha düşük konsantrasyonlarda S. cerevisiae'yi inhibe ettiği rapor edilmiştir. Bu çalışmada, bir tersine metabolik mühendislik stratejisi olan evrimsel mühendislik kullanılarak ilk defa koniferil aldehite yüksek ölçüde dirençli S. cerevisiae suşları elde edilmiştir. Etilmetan sulfonat (EMS) ile mutasyona uğratılmış S. cerevisiae, kesikli kültürlerde kademeli olarak artan koniferil aldehit stresine maruz bırakılarak sistematik bir seçilim yapılmıştır. Seçilim 0.25 mM koniferil aldehit varlığında başlatılarak 113. ve son popülasyona gelindiğinde 2.54 mM'ye ulaşmıştır. Seçilimin son popülasyonu 1.5 mM koniferil aldehit içeren katı besiyerine ekilerek tek koloniler izole edilmiştir. İzole edilen suşların yüksek koniferil aldehit direncine sahip olduğu ve genetik olarak kararlı oldukları tespit edilmiştir. Bu suşların OD600 değerleri, 2 mM koniferil aldehit stresi varlığında bile %90'a kadar korunurken, referans suşta 24 saat içinde üreme gözlenmemiştir. Bu suşların, vanilin, ferulik asit ve kafeine karşı da dirençli iken, etanol ve 2-fenil etanole karşı hafif düzeyde hassas oldukları görülmüştür. Koniferil aldehite dirençli suşlardan biri (BH13) detaylı olarak fizyolojik, transkriptomik ve genomik seviyede karakterize edilmiştir. BH13, 1.2 mM koniferil aldehit stresinin varlığında referans suştan yaklaşık 4 kat daha kısa sürede logaritmik büyüme fazına geçebilmiştir. Ayrıca, koniferil aldehit direncinin iyileştirilmesi sırasında, büyüme hızından (μ) ödün verilmemiştir. İki suşun biyokütle ve etanol verimleri, 1.2 mM koniferil aldehit varlığında veya yokluğunda benzer bulunmuştur. Bununla birlikte, BH13 her koşulda önemli ölçüde daha fazla gliserol üretmiştir. Diğer yandan, BH13, stressiz koşulda bile, 24 saatlik büyüme sonunda referans suşa kıyasla yaklaşık 5 kat fazla miktarlarda hücre içi trehaloz ve 8 kattan fazla glikojen biriktirmiştir. Koniferil aldehitin hücre duvarı üzerinde etkisi β- 1,3-glukan yıkıcı bir enzim olan litikaza duyarlılık analizi ile dolaylı olarak incelenmiştir. Koniferil aldehitin hücre duvarı üzerinde etkili olabileceği, fakat BH13 ve referans suşun litikaza duyarlılık derecelerinin benzer olduğu görülmüştür. Büyüme ortamında mevcut olan koniferil aldehitin miktarındaki zamana karşı değişim incelendiğinde, BH13'ün koniferil aldehiti, referans suştan daha hızlı bir şekilde katabolize ettiği gözlemlenmiştir. Büyüme eğrileri göz önüne alındığında, BH13 suşunda, koniferil aldehit yıkımı lag büyüme fazı ile başlayarak logaritmik faz boyunca devam ettiği; referans suşunda ise besiyerinde bulunan koniferil aldehitin %90'dan fazlasının katabolize edildikten sonra logaritmik büyüme fazına geçildiği saptanmıştır. BH13 ve referans suşun global gen anlatım profillerini karşılaştırmak için DNA mikrodizin teknolojisi kullanılmıştır. Transkriptom analizinde kullanılan toplam RNA, koniferil aldehit içermeyen besiyerinde orta-eksponansiyel faza dek büyütülen xxii kültürlerden izole edilmiştir. Transkriptom analizi sonucunda, anlatım düzeyi BH13'te istatistiksel olarak en az 2 kat değişiklik gösteren (p
Özet (Çeviri)
Phenolic compounds are a group of inhibitors generated during hydrolysis of lignocellulose. Phenolics in hydrolysates interfere with the performance of the yeast Saccharomyces cerevisiae and lead to reduced product yields. The phenolics are a chemically diverse group and their inhibition mechanism has not been fully understood yet. Coniferyl aldehyde is one of the most toxic phenolic compounds present in hydrolysates. In this study, highly coniferyl aldehyde-resistant S. cerevisiae strains were successfully obtained for the first time by using evolutionary engineering, an inverse metabolic engineering strategy. A chemically mutagenized S. cerevisiae population was subjected to systematic selection in the presence of gradually increased coniferyl aldehyde stress in successive batch cultures. The selection was started at 0.25 mM and coniferyl aldehyde concentration was increased to 2.54 mM after 113 populations. Genetically stable evolved strains with high coniferyl aldehyde resistance were isolated from the culture on the last day of the selection. The evolved strains retained up to 90% of their final OD600 even in the presence of 2 mM coniferyl aldehyde stress, while the growth of the reference strain was not observed within 24h of incubation. The evolved strains became resistant to vanillin, ferulic acid and caffeine as well, while they were slightly sensitive to ethanol and 2-phenyl ethanol. One of the coniferyl aldehyde-resistant strains (BH13) was characterized at the physiological, transcriptomic and genomic level. BH13 had a significantly reduced lag phase, which was less than 3 h and only about 25% of that of the reference strain in the presence of 1.2 mM coniferyl aldehyde stress. Besides, the growth rate (μ) was not compromised during the improvement of the coniferyl aldehyde resistance, either. Biomass and ethanol yields of the two strains were similar, both in the absence and presence of 1.2 mM coniferyl aldehyde. However, BH13 produced significantly more glycerol in any condition. This strain also catabolized the coniferyl aldehyde present in the growth medium faster than the reference strain and accumulated significantly higher amounts of intracellular trehalose and glycogen at 24 h of the growth even in the stress-free medium. The degree of susceptibility to lyticase, a β-1,3-glucan-degrading enzyme, was similar between the CA-resistant and the reference strain. Transcriptome analysis based on DNA microarray identified a total of 581 upregulated and 744 downregulated genes with statistically altered expression levels (corrected p
Benzer Tezler
- Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae
Kafeine dirençli saccharomcyes cerevisiae'nin tersine metabolik mühendislik ile eldesi ve moleküler karakterizasyonu
YUSUF SÜRMELİ
Doktora
İngilizce
2020
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Evolutionary engineering and molecular characterization of ethanol-resistant Saccharomyces cerevisiae
Etanole dirençli Saccharomyces cerevisiae?nin evrimsel mühendisliği ve moleküler karakterizasyonu
BURCU TURANLI YILDIZ
Doktora
İngilizce
2012
Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. Z. PETEK ÇAKAR
- Molecular and physiological characterization of iron resistant Saccharomyces cerevisiae
Demire dirençli Saccharomyces cerevisiae'nın moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu
BERRAK GÜLÇİN BALABAN
Doktora
İngilizce
2016
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Evolutionary engineering and molecular characterization of stress-resistant Saccharomyces cerevisiae mutants
Strese dirençli Saccharomyces cerevisiae mutantlarının evrimsel mühendisliği ve moleküler karakterizasyonu
CEREN ALKIM
Doktora
İngilizce
2012
Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Molecular characterization of phenylethanol resistance in Saccharomyces cerevisiae
Feniletanol direncinin Saccharomyces cerevısıae'de moleküler karakterizasyonu
CAN HOLYAVKİN
Doktora
İngilizce
2023
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR