Investigation of the change in BMAL1 levels in response to mitochondrial uncoupling in HEPG2 cells
HEPG2 hücrelerinde mitokondriyal kenetsizlenme sonucunda değişen BMAL1 ifadesinin araştırılması
- Tez No: 556610
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ HÜSEYİN ÇİMEN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Yeditepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 71
Özet
Mitokondriyal membran potansiyelinin bozulmuş olduğu HepG2 hücrelerinde, bir moleküler saat proteini olan BMAL1'in ritmik ifade paterninin bozulduğu ve ifade seviyesinin oldukça düştüğü literatürdeki bir çalışmada ortaya konmuştur; ancak BMAL1 proteinin ifade seviyesindeki bu değişimlerin nasıl gerçekleştiği açığa kavuşturulamamıştır. Bu çalışmada, BMAL1 protein ifadesindeki değişimlerin hangi yolak doğrultusunda gerçekleştiği araştırılmıştır. Öncelikle, serum şoku uygulamasıyla HepG2 hücrelerinin senkronizasyonu sağlanıp BMAL1 proteinin ritmik ifade paterni immunoemdirim tekniği ile elde edilmiştir. BMAL1 proteinin en yüksek ifade seviyesine ulaştığı zaman dilimi ise Cosinor analizi ile, daha sonraki immunoemdirim deneylerinde bu saat örneğini kullanmak üzere, 12. saat olarak tespit edilmiştir. FCCP uygulanan hücrelerde oksidatif fosforilasyonun kenetsizlenmesi sonucunda mitokondriyal membran potansiyelinde bozulma olup olmadığı Rhodamine123 ve MitoTracker Green FM ile boyanan hücrelerin konfokal lazer taramalı mikroskopta incelenmesi ile test edilmiştir. Bunun sonucunda, FCCP uygulanmış hücrelerin mitokondriyal membran potansiyelinde yüzde 79'luk bir düşüş tespit edilmiştir. Daha sonra, BMAL1 ifadesindeki değişimlerin bir deasetilaz olan SIRT1 aracılığıyla gerçekleştiği hipotezine dayanarak, hücrelere bir SIRT1 inhibitörü olan EX527 uygulanmıştır. EX527'nin etkinliğini tespit etmek için toplam protein asetilasyonu seviyesi immunoemdirim tekniğiyle incelenmiştir. Beklendiği gibi, toplam protein asetilasyonunda anlamlı artışlar gözlenmiştir. Son olarak, FCCP, EX527, FCCP ve EX527 uygulanmış örnekler arasında BMAL1 seviyesindeki farklılıklar immunoemdirim tekniğiyle incelenmiştir. Literatürdeki bulgulara uygun olarak, FCCP uygulanmış örneğin BMAL1 seviyesinde kontrole göre yüzde 63'lük bir azalma tespit edilmiştir; ancak FCCP ve EX527'nin birlikte uygulandığı örnekte BMAL1 seviyesinin kontrole yakın olduğu bulunmuştur. Dolayısıyla, SIRT1 enziminin aktivitesinin HepG2 hücrelerinin BMAL1 seviyesinde FCCP uygulaması ile meydana gelen azalmaya yol açan yolak üzerinde etkisi olduğu çıkarımı yapılmıştır.
Özet (Çeviri)
A study in 2016 demonstrated that the rhythmicity in BMAL1 expression was lost and the expression level of BMAL1 significantly decreased in HepG2 cells with depolarized membrane potential. However, the pathway leading to these changes in BMAL1 levels has not been elucidated. In this study, the molecular mechanism behind the changes in BMAL1 levels was investigated. First, the circadian expression of BMAL1 in serum shock- synchronized HepG2 cells was demonstrated by western blot assay. In order to detect the changes in BMAL1 expression more precisely, the timepoint at which BMAL1 levels peak was determined by Cosinor analysis. Mitochondrial membrane potential was measured in trifluoromethoxy carbonylcyanide phenylhydrazone (FCCP)-treated cells to observe if FCCP-induced uncoupling of oxidative phosphorylation led to mitochondrial membrane depolarization. A 79 percent decrease was detected in mitochondrial membrane potential of FCCP-treated cells as a result of confocal laser scanning microscopy analysis of Rhodamine123- and MitoTracker Green FM-stained cells. Next, a specific SIRT inhibitor, EX527 was applied to cells to investigate if there was a link between SIRT1 activity and BMAL1 downregulation in FCCP-treated cells. After confirming SIRT1 inhibition by detecting significant increases in total protein acetylation in EX527-treated cells, BMAL1 expression was investigated by western blot assay. In accordance with the findings in the literature, BMAL1 was downregulated by 63 percent in FCCP-treated cells with respect to control. However, cells which were treated with both FCCP and EX527 were found to have BMAL1 levels similar to the control which indicates SIRT1 inhibition restores BMAL1 downregulation mediated by FCCP. Consequently, SIRT1 activity was considered to be involved in the pathway leading to BMAL1 downregulation in HepG2 cells in response to FCCP-induced mitochondrial membrane depolarization.
Benzer Tezler
- Sirkadiyen döngü değişikliklerinde hipokampal öğrenmenin araştırılması
Investigation of hippocampal learning in circadian cycle changes
MERVEHATUN BOYRAZ
- Parafine gömülü pankreas kanseri doku örneklerinde sirkadiyen ritim genlerinin ekspresyonlarının araştırılması
Investigation of expressions of circadian rhythm genes in parafined embedded pancreas cancer tissue samples
UĞUR KESKİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
GenetikAkdeniz ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYŞE ESRA MANGUOĞLU AYDEMİR
- Sirkadiyen Döngü Değişikliklerinde Sinaptik Plastisitenin Araştırılması
Investıgatıon Of Synaptıc Plastıcıty In Cırcadıan Cycle Changes
FATMA BOZ
- BMAL1'in beyin hasarı sonrası rolünün proteomik açıdan incelenmesi
Investigation of the role of BMAL1 following brain injury using proteomic approaches
ELİF ÖZBAY
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Tıbbi Biyolojiİstanbul Medipol ÜniversitesiSinir Bilimi Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSTAFA ÇAĞLAR BEKER
- Etkinlik temelli öğretim sonucunda ortaokul öğrencilerinin prizma ve piramit kavramlarını anlayışlarındaki değişimin incelenmesi
Investigation of the change in secondary students' understanding of the prism and pyramid conceptions as a result of activity-based education
SATI AKGÜL
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
MatematikBolu Abant İzzet Baysal ÜniversitesiMatematik ve Fen Bilimleri Eğitimi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZÜLBİYE TOLUK UÇAR