Design and construction of double promoter systems andtheir use in pharmaceutical protein production inP. pastoris
P. pastoris ikili-promotör sistemleri tasarımı ve oluşturulması ile farmasötik protein üretimine katkısı
- Tez No: 570158
- Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 209
Özet
Promotor gücü, mRNA sekonder yapısı, translasyon etkinliği ve kodon seçimi, 5′- çevrilmemiş- (untranslated-) bölge işleme ve protein devri gibi hücreiçi olaylar heterolog genlerin ekspresyonu üzerinde doğrudan etkilidir. Promotor kuvvetini artırmak için, kuvvetli promotorleri ve mühendislik promotor varyantlarını içeren çoklu-promotor ekspresyon sistemleri tasarımı, Pichia pastoris'te rekombinant protein (r-protein) üretimi ve verimliliği artırmak için yeni metabolik mühendislik stratejisidir. mApple ve eGFP genlerini taşıyan ikili-promotor ekspresyon sistemleri (DPES), iki-fazlı prosesin üretim fazında her promotorun eşanlı veya ardışık-tekrarlı birinden-diğerine geçen ekspresyon peryodlarını belirlemek ve kesinleştirmek için, heterolog proteinler mApple and eGFP sentezi için tasarlanmış ve oluşturulmuştur. Ekspresyon-kaset kütüphanesi, bir doğal promotor (NOP) ve iki mühendislik yapılmış yeni promotor varyantı (NEPV) i) alkol dehidrojenaz-1 geni (ADH1) için NEPV, ii) alkol oksidaz-1 geni (AOX1) için NEPV, ve iii) PGAP (NOP), ile önce tasarlanmış; sonra P. pastoris ikili-promotor ekspresyon sistemleri (DPES) ayrı-ayrı ekspresyon kasetleri olarak tasarlanmış ve oluşturulmuştur. Oluşturulan yeni suşlar ile bifazik P. pastoris %2 etanol, aşırı glikoz ve aşırı gliserol fermentasyon koşullarında test edilmiştir. P. pastoris her biri farklı antibiyotik direnç genine sahip iki ekspresyon kasetli ikili-promotor ekspresyon sistemleri; i) pADH2-Cat8-L2::mApple ve pGAP::eGFP, ii) pADH2-Cat8-L2::mApple ve pmAOX1::eGFP, iii) pADH2-Cat8-L2::mApple ve pADH2-Cat8-L2::eGFP, iv) pGAP::eGFP ve pGAP::eGFP v) pmAOX1::eGFP ve pmAOX1::eGFP tasarlanıp oluşturulmuştur. mApple ve eGFP proteinleri : i) pADH2-Cat8-L2::mApple ve pGAP::eGFP ardışık / eşanlı; ii) pADH2-Cat8-L2::mApple ve pmAOX1::eGFP bifonksiyonel ve eşanlı; iii) pADH2-Cat8-L2::mApple ve pADH2-Cat8-L2::mApple; iv) pGAP::eGFP ve pGAP::eGFP; v) pmAOX1::eGFP ve pmAOX1::eGFP ikiz-promotorlarla eşanlı, oluşturulan yeni P. pastoris suşlarında ekspres edilmiştir. Oluşturulan DPES PmADH+mAOX1 ve tek-promotorlu PADH2-Cat8-L2 ve PmAOX1 ekspresyon sistemleriyle kıyaslandığında floresans protein üretimi 2.1-kat artmıştır. Eşzamanlı-çalışan PADH2-Cat8-L2+mAOX1 ile etanoldeki ekspresyon PADH2-Cat8-L2+GAP ile ardışık-çalışan DPES'e göre 1.6-kat artmıştır. DPES'lerin gücü, hücre-dışı rekombinant insan büyüme hormunu üretimi için yapılan fermentasyonlarda denenmiştir. Fermentasyon prosesinin t = 48 st'inda, PADH2-Cat8-L2, PmAOX1, PGAP, PADH2-Cat8-L2+mAOX1, PADH2-Cat8-L2+GAP, ve PADH2-Cat8-L2+ADH2-Cat8-L2 ile oluşturulan P. pastoris hücrelerinden biyoreaktör üretim ortamına aktarılan rhGH verimleri, sırasıyla, 2.95, 3.00, 0.13, 4.86 3.73 ve 4.21mg/g'dır.
Özet (Çeviri)
Intracellular phenomena such as promoter strength, mRNA secondary structure, translation efficiency and codon preference, 5′-untranslated region processing, and protein turnover, have impacts directly on the expression of heterologous genes. Design of multi-promoter expression systems with constituent strong promoters and engineered promoter variants is a novel metabolic engineering strategy for increasing the promoter strength further, and tuning the expression for recombinant protein (r-protein) production with enhanced production and productivity in the yeast P. pastoris. Double-promoter expression systems (DPESs) carrying enhanced green fluorescent protein (eGFP) and red fluorescent protein (mApple) genes were designed and constructed for the synthesis of the heterologous model proteins mApple and eGFP in order to determine and justify the expression period of each promoter that can be either simultaneously, or by consecutively stimulating the changeover from one to another in a biphasic process or via successive-iterations in methanol-free media, on glucose, glycerol or ethanol. A library of expression cassettes was designed with single naturally occurring promoters (NOPs) and novel-engineered promoter variants (NEPVs) having distinct regulatory properties: i) a NEPV of alcohol dehydrogenase1 gene (ADH1), ii) a NEPV of alcohol oxidase 1 gene (AOX1), and iii) PGAP; and P. pastoris DPESs have been constructed as separate expression cassettes. Novel P. pastoris strains were constructed with the DPESs and tested in the fed-batch phase of the fermentation of the carbon sources 2% (v/v) ethanol, excess glucose, and excess glycerol. P. pastoris DPESs having double expression cassettes each having a different antibiotic resistance gene were constructed, denoted by; i) pADH2-Cat8-L2::mApple and pGAP::eGFP, ii) pADH2-Cat8-L2::mApple and pmAOX1::eGFP, iii)pADH2-Cat8-L2::mApple and pADH2-Cat8-L2::mApple, iv) pGAP::eGFP andpGAP::eGFP v) pmAOX1::eGFP and pmAOX1::eGFP. The proteins mApple and eGFP were expressed in the novel P. pastoris strains constructed with: i) pADH2-Cat8-L2::mApple and pGAP::eGFP consecutively and also simultaneously; ii) pADH2-Cat8-L2::mApple and pmAOX1::eGFP bifunctionally and simultaneously; iii)pADH2-Cat8-L2::mApple and pADH2-Cat8-L2::mApple; iv) GAP::eGFP andpGAP::eGFP; v) pmAOX1::eGFP and pmAOX1::eGFP simultaneously as identical-twin promoters. PADH2-Cat8-L2+mAOX1DPES increased the production capacity on ethanol 2.1-fold compared to that with the single NEPVs PADH2-Cat8-L2 and PmAOX1, respectively. With PADH2-Cat8-L2+mAOX1, the expression increased to 1.3-fold on ethanol compared to that with identical-twin promoters. With simultaneously-operating PADH2-Cat8-L2+mAOX1 the expression was 1.6-fold higher than the consecutively-operating PADH2-Cat8-L2+GAP on ethanol. Strength of the DPESs were tested in fermentations for extracellular human growth hormone (rhGH) production. Secreted rhGH yields (YP/X, mg/gDW) by novel P. pastoris strains constructed with PADH2-Cat8-L2, PmAOX1, PGAP, PADH2-Cat8-L2+mAOX1, PADH2-Cat8-L2+GAP, and PADH2-Cat8-L2+ADH2-Cat8-L2 were as 2.95, 3.00, 0.13, 4.86, 3.73 and 4.21 mg/g at t = 48 h of the fermentations on ethanol, respectively.
Benzer Tezler
- Gliserolden 1,2-propilen glikol üretim prosesinin tasarım ve kontrolü
Production of 1,2-propylene glycol from glycerol design and control
ATİLLA ÖZCAN KARAAĞAÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. DEVRİM BARIŞ KAYMAK
- Sokollu Mehmed Paşa'nın İstanbul'daki imar faaliyetleri
Building activities in Istanbul of Sokollu Mehmed Pasha
FATMA ZEHRA POLATTAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Mimarlıkİstanbul Teknik ÜniversitesiMimarlık Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATMA İLKNUR KOLAY
- Ulaştırma altyapı projelerinin finansmanı
Başlık çevirisi yok
ŞEBNEM DOĞRU
Yüksek Lisans
Türkçe
1997
İnşaat Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesiİnşaat Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜNGÖR EREN
- 8086 Mikroişlemcili, çok fonksiyonlu çevre cihazlı komple bir deney seti tasarımı, imalatı ve uygulaması
Design and construction of a multifinctioned unit comprising 8086 type microp
MEHMET VEHBİ SAYIN
Yüksek Lisans
Türkçe
1994
Elektrik ve Elektronik MühendisliğiSelçuk ÜniversitesiElektrik-Elektronik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET BAYRAK
- A Development of computer programs on the analysis and computer aided design of space trusses for practical engineering usage
Başlık çevirisi yok
ULUĞ CAM
Yüksek Lisans
İngilizce
1994
İnşaat MühendisliğiDokuz Eylül Üniversitesiİnşaat Mühendisliği Ana Bilim Dalı
MEHMET ERŞEN ÜLKÜDAŞ