Geri Dön

Untersuclıungen transienter Transformanten von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

Untersuclıungen transienter Transformanten von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

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  1. Tez No: 665106
  2. Yazar: NECLA BİRGÜL
  3. Danışmanlar: DR. ROLF RESKİ, PROF. DR. WOLFGONG ABEL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 1997
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Universität Hamburg
  10. Enstitü: Yurtdışı Enstitü
  11. Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 75

Özet

P.patens yosunu! karada! yaşayan! basit! ökaryotik! haploid! bir! organizmadır.! Hem! laboratuar!ortamında! yetiştirilmesi!kolay!hemde!haploid!olması!nedeni!ile!genetik! araştırmalarda!kullanılmaktadır.!Yosunlarda! transformasyon!geçici! ve!kalıcı!olmak! üzere! iki! çeşittir,! ancak! verimi! çok! düşüktür! (3C5%)! ve! bu! transformasyonlarda! homolog! rekombinasyon! olup! olmadığı! bilinmemektedir.! Tez! kapsamında! çeşitli! intron'lu!vektörler!kullanılarak!“particle#gun”!tekniği!ile!P.#patens'e!transformasyon! yapılmıştır.! Transforme! olan! yosunlardan! genomik!DNA!izole! edilip! Southern! blot! analizine! tabi! tutulmuştur.! Bu! şekilde! yapılan! transformasyon! genoma! entegre! olmuş!ise! homolog! rekombinasyon! vasıtasıyla! olduğu! varsayılacaktı.! Çıkan! sonuca! göre!Southern!blot'da!sadece!ekstrakromosomal!DNA!belirlenmiş!olup!boyutları!da! modifiye!olarak!faklı!boyutlarda!tespit!edilmiştir.!Bunun!sebebi!vektörlerde!bulunan! güçlü! promotör! kullanımından! kaynaklanmış! olabileceği! düşünülmüştür,! ayrıca! vektörlerin!transformasyon!esnasında!delesyona!uğradıkları!da!düşünülmüştür.!

Özet (Çeviri)

ln dieser Arbeit wurde das aUgemeine Rekombinationsvermögen durch die biolistische Transfomıation mit den NPTII-lntronkonstrukten in Physcomitrella untersucbt. Die biolistische Transformation erfolgte durch vier unterschiedlich positionierte synthetiscbe lntronkonstrukte an der durch MNNG induzierte Mutante pabA3 (Ashton & Cove, J 977). Durcb die biolistische Transfonnation wurden keine stabilen, dafür viele nichtstabile und transiente Transformanten erhalten. Auch durch die Transformation des Kontrollkonstruktes pTJ 3d2 wurden kcine stabilen Transformanten erhalten. Als zusatiliches Kontrollkonstrukt wurde pJJT/61 verwendet, wobei durch dieses Konstrukt stabile Transformanten erhalten wurde. Der Unterschied dieser Plasmide besteht in deren Pomotor und deren Grö8e. Das Konst:ru11 p.llT16J enthalt einen vom Promotor des CaMV 35S Promoter und die GröBe dieses Plasmids betragt 4.221Kb. Das Konstrul1 pTI 3d2 enthalt ein vom Promotor des Nopalinsynthasegens und ibre GröBe betragt 3.888Kb. Eine Erhöhung der DNA­ k Konzentration ın der Transformationssuspension wirte sich positiv auf die Transformationsrate aus. Weshalb keine stabilen Transformanten durch die NPTII-Intronkonstrukte erhalten wurde, liegt höchstwahrscheinlich an den Konstrukten und nicht an den unterschiedlich positionierten synthetischen Introns (pers. Mitteilung von Dr. C.D.Knigbt). Denn auch durch das KontrollkonstruktpTJ3d2 konnten keine stabilen Transforrnanten erhalten werden. Bei einem Vergleich zwischen den beiden Kontrollkonstrukten, fal len die unterschiedlichen Promotoren auf. Die Starke des Promotors kann eventuell auch ein Grund dafür sein (pers. Mitteilung von Dr. C.D.Knight). Weiterhin wurde in der stabi1 transformierten Mooskultur (Bar/pBI22:23 und Nar/ pBI22:23) aus der genomischen DNA im Agarosegel extrachromosomale Fragmente detektiert. Diese Fragmente wurdeo oaher charakterisiert. Nach einer Eluierung der Banden. aus dem Agarosegel, konnte eine Transfonnation über Elektroporation in E.coli durchgeführt werden. Nach einer Minipraparation der Plasmide, wurden im Agarosegel Banden detektiert. Diese Plasmide wurden durch unterschiedliche Restriktionsenzyrne gespalten und eine Restriktionskarte erstellt. Das Plasmid BarlpB/221:23/4Kb zeigte das identische Restriktionsmuster, welches ursprünglich in die Mooskultur transformiert wurde. Eine Soutbem-Analyse bestatigte dieses Ergebnis. Dieses war der Beweis, dafi das Fragment - welches extrachromosomal in der unrestringierten ONA im Agarosegel lokalisiert war - sich um das Plasmid handelt. Die restlichen Fragmente, die ebenfalls aus dem Agarosege] eluiert wurden, zeigten unterschiedliche Restriktionsmuster. Das Plasmid BarlpB1221 :2312Kb wies eine Gröfie von 8.900Kb auf, wobei das ursprüngliche Plasmid eine GröBe von 6.986Kb hatte. Das Plasmid NarlpBl221:23/4Kb und das Plasmid Nar/p8!221:23/2Kb wiesen eine GröBe von 3.500Kb auf Vermutlich entstand durch eine Duplikation und Deletion wahrend der Rekombination der Plasmide diese Gröfien. Inwieweit welche Gene dupliziert oder deletiert wurden, konnte nicht genau bewiesen werden. Durch eine Southem-Analyse konnte keine Hybridisierung dieser Plasmide festgestellt werden d.h. das die Plasmide ein verandertes Hygromycingen oder keines enthalten. Um eine naherc Aussage der Duplikation u.nd der Deletion machen zu können, könnte eine Sequenzanalyse sehr hilfreich sein.

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