Geri Dön

Understanding how loss of histone H3 lysine 36 trimethylation enhances somatic cell reprogramming

Histon H3 lizin 36 üç-metil kaybının somatik hücre yeniden programlamasını nasıl geliştirdiğinin anlaşılması

  1. Tez No: 728870
  2. Yazar: BÜŞRA BAYIRBAŞI
  3. Danışmanlar: PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Genetik, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2021
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Koç Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 132

Özet

Somatik hücreler, bir dizi transkripsiyon faktörü (OCT4, SOX2, KLF4 ve c-MYC) kullanılarak uyarılmış pluripotent kök hücrelere (UPKH) yeniden programlanabilir. Bununla birlikte, somatik hücrelerin UPKH'lere yeniden programlanması, yeniden programlamaya karşı engellerin varlığını gösteren çok düşük verimlilikten mustariptir. DNA ve histonların translasyon sonrası modifikasyonlarını düzenleyen epigenetik faktörler, yeniden programlamanın bu tür engelleri arasındadır. Ön çalışmamızda, histon H3 lizin 36 üç-metillenmesini (H3K36me3) katalize eden memelilerdeki tek enzim SETD2'nin yeniden programlamanın bir bariyeri olduğu gösterilmiştir. H3K36me3, aktif transkripsiyon gösteren genlerin gen gövdeleri boyunca biriken bir histon işaretidir. Bu tezde, H3K36me3 kaybının UPKH oluşumunu nasıl geliştirdiğinin moleküler mekanizmalarını araştırdım. H3K36me3 kaybının yeniden programlama verimliliğini nasıl artırdığını anlamak için birkaç hipotez önerdim. İlk olarak, ön çalışmamızdaki RNA dizileme analiziyle belirlenen SETD2 baskılanmasıyla ekspresyonu azalan genler arasından dört transkripsiyon faktörünü (CITED2, EBF3, SMAD3 ve FOSL1) yeniden programlamada test ettim. Bu transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonunun, SETD2 baskılanmasıyla artan yeniden programlama fenotipini tersine çevirip çeviremeyeceğini test ettim. Bu transkripsiyon faktörlerinin hiçbirinin SETD2 baskılanmasıyla artan yeniden programlama verimliliğini tek başına azaltamayacağını gösterdim. Deneylerin ikinci kısmında, birbirini dışlayarak histon H3'ün kuyruklarında biriken aktif H3K36me3 ve baskılayıcı H3K27me3 işaretleri için kromatin immünopresipitasyon (ChIP) gerçekleştirdim. H3K36me3 kaybının H3K27me3 birikimine yol açıp açmayacağını araştırmak için, SETD2 baskılanması ile ekspresyonu azalan genler üzerindeki H3K27me3 dağılımını analiz ettim. Ancak ChIP-qPCR sonuçları, SMAD3, LPAR1, EBF3 ve SFRP1 gibi seçilen genler üzerindeki bu iki işaret arasında karşıt bir ilişki olduğunu göstermedi. Son olarak, yeniden programlamadaki rollerini anlamak amacıyla memelilerde bilinen tüm H3K36me3 okuyucularını hedefleyen CRISPR/Cas9 tabanlı bir tarama gerçekleştirdim. Hangi H3K36me3 okuyucusunun SETD2 tükenmesini feno-kopyalayacağını bulmayı amaçladım. Bu tarama, PSIP1, MRG15, MSH6, MSL3, NSD2 ve NSD3'ün yeniden programlamaya engel olduğunu gösterdi, çünkü bunların nakavtı yeniden programlama verimliliğini arttırdı. Bu okuyucular, yeniden programlamanın önündeki engeller olarak doğrulandı ve işleve yönelik testler için alternatif uç-birleştirme ile ilişkili H3K36me3 okuyucusu MRG15 seçildi. Bu nedenle, MRG15 baskılanmasının alternatif uç-birleştirme olaylarını etkileyerek yeniden programlamayı geliştirmiş olabileceğini test etmek amacıyla, yeniden programlama için önemli olduğu bilinen faktörlerin alternatif uç-birleştirmesi üzerinde SETD2 baskılanmasının etkisini analiz ettim. RT-qPCR analizi, hem SETD2 baskılanmasının hem de MRG15 nakavtının ayrı ayrı MBD2'nin pluripotent hücrelere özgü varyantının ekspresyonunda önemli bir artışa yol açtığını gösterdi. Bu sonuçlar, H3K36 üç-metillenmesini okuyarak somatik hücre yeniden programlamasına karşı bariyer oluşturan faktörleri ve H3K36me3 kaybının somatik hücre yeniden programlamasını nasıl geliştirdiğine altta yatan bir mekanizma olarak MBD2 geninin alternatif uç-birleştirmesini göstermiştir.

Özet (Çeviri)

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using a set of transcription factors (OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC). However, reprogramming of somatic cells to iPSCs suffers from a very low efficiency indicating the presence of barriers against reprogramming. Epigenetic factors regulating post-translational modifications of DNA and histones are among such barriers of reprogramming. In a preliminary study, SETD2 which is the only enzyme catalyzing histone H3 lysine 36 tri-methylation (H3K36me3) in mammals was shown to be a barrier of reprogramming. H3K36me3 is a histone mark deposited throughout gene bodies of actively transcribed genes. In this thesis, I investigated the molecular mechanisms of how H3K36me3 loss enhances iPSC generation. I proposed several hypotheses to understand how H3K36me3 loss increases reprogramming efficiency. First, by analyzing previously generated RNA-sequencing data, I considered four transcription factors (CITED2, EBF3, SMAD3 and FOSL1) downregulated by SETD2 knockdown as candidate SETD2-downstream genes. I tested whether overexpression of these transcription factors could reverse the increased reprogramming phenotype of SETD2 knockdown. I showed that none of these transcription factors could alone decrease the increased reprogramming efficiency by SETD2 knockdown. In a second line of experiments, I carried out chromatin immunoprecipitation (ChIP) for active H3K36me3 and repressive H3K27me3 marks, which are deposited in a mutually exclusively manner on the tails of histone H3. I analyzed the distribution of H3K27me3 on the genes downregulated upon SETD2 knockdown to investigate whether H3K36me3 loss could lead to H3K27me3 deposition. However, ChIP-qPCR results did not indicate a reciprocal relationship between these two marks on the selected genes such as SMAD3, LPAR1, EBF3 and SFRP1. Lastly, I performed a CRISPR/Cas9-based knockout screen targeting all known H3K36me3 readers in mammals to define the roles of these readers in somatic cell reprogramming. H3K36me3 readers are involved in diverse cellular processes such as alternative splicing, DNA repair, transcription elongation and DNA and histone methylation. Therefore, I aimed to find which H3K36me3 reader could phenocopy SETD2 depletion in reprogramming. CRISPR-based screen demonstrated that PSIP1, MRG15, MSH6, MSL3, NSD2 and NSD3 are barriers against reprogramming as their knockout led to increased reprogramming efficiency. These H3K36me3 readers were validated as barriers to reprogramming and MRG15, the H3K36me3 reader associated with regulation of alternative splicing was chosen for function-related assays. Therefore, I analyzed the effect of SETD2 knockdown on alternative splicing of key factors known to be significant for reprogramming with the goal of understanding whether SETD2 inhibition promotes reprogramming by regulating alternative splicing. Through RT-qPCR analysis, I observed that both SETD2 knockdown and MRG15 knockout individually led to a significant increase in the pluripotent cell-specific variant of MBD2 expression. Taken together, these findings identified the factors serving as barrier against somatic cell reprogramming through reading trimethylation of H3K36 residue and alternative splicing of MBD2 gene as an underlying mechanism for enhanced reprogramming by H3K36me3 loss.

Benzer Tezler

  1. Determining the effects of DOT1L interacting proteins on cellular reprogramming

    DOT1L ile etkileşen proteinlerin hücrenin yeniden programlama tekniğine etkilerinin belirlenmesi

    DENİZ UĞURLU ÇİMEN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Moleküler TıpKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER

  2. Spermden model membranlara lipit asimetrisinin kaybı

    The loss of lipid asymmetry: from sperm to lipid bilayers

    GÜLÇİN PEKKURNAZ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2009

    Tıbbi BiyolojiAnkara Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ASUMAN SUNGUROĞLU

    PROF. DR. JOSHUA ZIMMERBERG

  3. Doğu Anadolu Tektonik Bloğu'nun içsel deformasyon evrimi: Balık Gölü Fay Zonu'nun (Ağrı) morfotektonik özellikleri ve uzun dönem kayma hızının belirlenmesi

    Internal deformation evolution of East Anatolian Tectonic Block: Determining the morphotectonic properties and long term slip rate of Balik Lake Fault Zone (Ağri)

    AYLİN NAR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Jeoloji MühendisliğiVan Yüzüncü Yıl Üniversitesi

    Jeoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AZAD SAĞLAM SELÇUK

  4. War trauma and its subjective meanings: An exploration on 'Mehmedin Kitabi: Güneydoğu'da savaşmış askerler anlatiyor'

    Savaş travması ve öznel anlamları: 'Mehmedin Kitabı: Güneydoğu'da savaşmış askerler anlatıyor' üzerine bir inceleme

    DENİZ YILMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    Psikolojiİstanbul Bilgi Üniversitesi

    Psikoloji Bölümü

    YRD. DOÇ. DR. MURAT PAKER

  5. Soğuk şekillendirilmiş kirişlerin gövdesinde açılmış dairesel deliklerin eğilme davranışının etkisi: Sonlu eleman analizleri

    Effect of flexural behavior of circular holes opened in the body of cold-formed beams: Finite element analyzes

    EKİN ABANOZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    İnşaat MühendisliğiSakarya Üniversitesi

    İnşaat Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZEYNEP YAMAN

    DOÇ. DR. MAHYAR MAALI