Establishment of Cas9 endonuclease technology in rye
Çavdarda Cas9 endonükleaz teknolojisinin kullanilmasi
- Tez No: 743252
- Danışmanlar: DOÇ. DR. EVREN KOBAN BAŞTANLAR, DR. SAMEH SELİM
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Ziraat, Agriculture
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Ege Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tohumluk Bilimi ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Tohumluk Bilimi ve Teknolojileri Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 106
Özet
Çavdar (Secale cereale L.), biyoteknolojik yaklaşımlara karşı oldukça dirençli olduğu kanıtlanan diploid bir kış/ilkbahar tahıl bitkisidir. Genetik ve fenotipik olarak çok yönlü olan bu bitki dünya çapında ekmek üretmek için en önemli ikinci mahsuldür ve yeşil formunda çiftlik hayvanları için de yem olarak kullanılır. Yüksek potansiyelinin aksine, haploid teknolojisi ve genetik mühendisliği ugulamaları henüz çavdar yetiştirme programlarında önemli bir rol oynamamıştır. CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme uygulamalarını mümkün kılabilecek bir gelişme olarak, çavdar genomu yakın zamanda yayınlanmıştır (Mart ve Ekim 2021). Sürgünlerin kallus oluşumu ve rejenerasyonu, genetik mühendisliği için ön koşul olan genotip ve kültür koşullarına oldukça bağlıdır. İnbred hatlardan No5 ve Lo7 (ikincisi dizili referans genomu temsil eder), daha önce yapılmış olan deneyler kapsamında bitki rejenerasyon sisteminde en iyi performans kaydedilmiştir. Bu elde edilen ön deneysel sonuçlar ışığında; çağdaş haploid teknolojisi ve genetik mühendisliği yaklaşımları için teknolojik bir temel sağlamak amacıyla, çavdarda hedeflenmiş bölgeye özgü mutasyonlar oluşturmak için RNA güdümlü Cas9 endonükleaz tabanlı genom düzenlemesi bu tez çalışması kapsamında uygulanmıştır. PLA1 geninde fonksiyon kaybının, mısır bitkisinde haploid indükleme kabiliyeti kazanmakla ilişkili olduğu daha önce gösterilmişti.Bu nedenle, gerçekleştirdiğimiz çalışmada Cas9 endonükleaz teknolojisini kullanarak hedeflenen mutagenez gerçekleştirmek için mısır FOSFOLİPAZ A1'in (PLA1) çavdar ortologunu ele aldık. Bu kapsamda; (Sc) PLA1 geninin 1, 2 ve 3 ekzonlarında dört hedef motif seçtik ve buna göre dört kılavuz RNA (gRNA) tasarladık. gRNA'ların yapısı ve tasarımı, çevrimiçi araçlar (RNA fold, WU-CRISPR ve Benchling) kullanılarak tasarlandı. Golden Gate klonlamasına dayalı CASCADE/Cas9 vektör dizilimi sistemi, çavdar transformasyonu için P6i binary vektöründe seçilen gRNA'ların ekspresyon kasetini klonlamak için kullanılmıştır. Cas9 ekspresyon kaseti, GFP seçim markörü ve gRNA'lar, tek bir golden gate PCR reaksiyonunda bir klonlama vektörüne bağlandı. ScPLA1 için yapılandırılmış vektörlerin fonksiyonel doğrulaması, çavdar protoplastlarının PEG aracılı transfeksiyonu kullanılarak gerçekleştirildi. İki genotip ve dört vektör protoplast transfeksiyonu için test edilmiştir. Konfokal mikroskopi altında sfGFP seçim markörü kullanılarak yapılan hesaplamada %75 transfeksiyon oranı elde edilmiştir. Mutasyona uğramış protoplastlardan DNA izole edilmiş ve hedeflenen kısmi gen fragmanları için PCR reaksiyonları yapılmıştır. Muhtemel mutasyon indüklenmesine işaret eden hedefe spesifik amplikonlar için çift bantlar içeren PCR sonuçları, dizileme analizi için saklanmıştır. Bu amplikonların dizilenmesinden elde edilecek sonuçların mutasyonları tam olarak belirlemesi beklenmektedir. Agrobacterium yoluyla stabil transformasyon, stabil transforme edilmiş çavdar bitkilerinde mutasyonun bir göstergesi olarak kullanılabilecek amplikon dizileme analizinden sonra yapılacaktır.
Özet (Çeviri)
Rye (Secale cereale L.) is a diploid winter/spring cereal plant which proved highly recalcitrant to biotechnological approaches. It is genetically and phenotypically highly versatile and the second most important crop to produce bread worldwide, while green plants are used as feed for livestock. In contrast to its high potential, haploid technology and genetic engineering have, as yet, not been playing a significant role in rye breeding programs. Rye genome has recently been published (March and October 2021), that made the applications of CRISPR-Cas9 based genome editing available. Callus formation and regeneration of shoots is highly dependent upon genotype and culture conditions, which are pre-requisites for genetic engineering. Inbred lines No5 and Lo7 (the latter representing the sequenced reference genome) showed the best performance in plant regeneration system in previous experiments. Taking advantage of this preliminary progress and to provide a technological basis for contemporary haploid technology and genetic engineering approaches, RNA-guided Cas9 endonuclease-based genome editing is applied to generate site-specific mutations in rye in context of this thesis study. The loss of function of the PLA1 gene was previously demonstrated to be sufficient to confer haploid-inducing capability in maize. Therefore, we addressed the rye orthologue of the maize PHOSPHOLIPASE A1 (PLA1) to perform targeted mutagenesis using Cas9 endonuclease technology. We selected four target motifs in exons 1, 2, and 3 of (Sc) PLA1 gene and designed four guide RNAs (gRNAs) accordingly. Structure and design of gRNAs was employed using online tools (RNA fold, WU-CRISPR and Benchling). CASCADE/Cas9 vector assembly system based on Golden Gate cloning was used to clone the expression cassette of the selected gRNAs in the P6i binary vector for rye transformation. Cas9 expression cassette, GFP selection marker and gRNAs were bound to an assembly vector in a single golden gate PCR reaction. Functional validation of constructed vectors for ScPLA1 was done using PEG-mediated transfection of rye protoplasts. Two genotypes and four vectors were tested for protoplast transfection and 75% transfection rate was observed using sfGFP as selection marker under confocal microscopy. DNA from mutated protoplasts was extracted and PCR reactions were performed for the targeted partial gene fragments. The PCR results containing double bands for the target specific amplicons, which indicate towards possible mutation induction, were stored for further sequencing analysis. The results to be obtained from sequencing of these amplicons are expected to exactly pinpoint the mutations. Stable transformation through Agrobacterium will be done after the analysis of amplicon sequencing which could be used as an indication of mutation in stably transformed rye plants.
Benzer Tezler
- A novel approach for CRISPR-dCas9-mediated neuroprotective gene therapies for inherited retinal diseases
Kalıtsal retina hastalıkları için CRISPR-dCas9-aracılı nöroprotektif gen tedavilerine yeni bir yaklaşım
HALİT YUSUF ALTAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyolojiSabancı ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CAVİT AĞCA
- CRISPR-Cas9 Teknolojisi ile in Vitro F8 geninin fonksiyonunun bozulmasının sağlanması
Impairment of F8 Gene function in Vitro with CRISPR-Cas9 technology
MAHDI SHEKARI
Doktora
Türkçe
2023
BiyoteknolojiEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FERİŞTAH FERDA ÖZKINAY
- Analysis of cell surface reorganization during cell division
Hücre bölünmesi sırasında hücre yüzey düzenlenmesinin analizi
NAZLI EZGİ ÖZKAN KÜÇÜK
Doktora
İngilizce
2018
BiyolojiKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. NURHAN ÖZLÜ
- Regulatory role of aplnr signaling in migration and differentiation of mesoderm tissue and mesenchymal stem cells
Aplnr sinyalinin mesoderm doku ve mezenkimal kök hücre farklılaşmasındaki ve migrasyonundaki düzenleyici rolü
HATİCE BURCU ŞİŞLİ
Doktora
İngilizce
2023
BiyomühendislikYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYŞEGÜL DOĞAN
- Establishment of the methods used in the molecular analysis of alzheimers diease in Turkey and the signifinance of apoe genotyping in healthy and diseases individuals
Alzheimer hastalığında kullanılan yöntemlerin Türkiye'de kurulması ve sağlıklı ve hasta bireylerde apoe genotiplemesinin önemi
MEHMET BAKİ YOKEŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
1999
BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. A. NAZLI BAŞAK