Establishment of Cas9 endonuclease technology in rye
Çavdarda Cas9 endonükleaz teknolojisinin kullanilmasi
- Tez No: 743252
- Danışmanlar: DOÇ. DR. EVREN KOBAN BAŞTANLAR, DR. SAMEH SELİM
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Ziraat, Agriculture
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Ege Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tohumluk Bilimi ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Tohumluk Bilimi ve Teknolojileri Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 106
Özet
Çavdar (Secale cereale L.), biyoteknolojik yaklaşımlara karşı oldukça dirençli olduğu kanıtlanan diploid bir kış/ilkbahar tahıl bitkisidir. Genetik ve fenotipik olarak çok yönlü olan bu bitki dünya çapında ekmek üretmek için en önemli ikinci mahsuldür ve yeşil formunda çiftlik hayvanları için de yem olarak kullanılır. Yüksek potansiyelinin aksine, haploid teknolojisi ve genetik mühendisliği ugulamaları henüz çavdar yetiştirme programlarında önemli bir rol oynamamıştır. CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme uygulamalarını mümkün kılabilecek bir gelişme olarak, çavdar genomu yakın zamanda yayınlanmıştır (Mart ve Ekim 2021). Sürgünlerin kallus oluşumu ve rejenerasyonu, genetik mühendisliği için ön koşul olan genotip ve kültür koşullarına oldukça bağlıdır. İnbred hatlardan No5 ve Lo7 (ikincisi dizili referans genomu temsil eder), daha önce yapılmış olan deneyler kapsamında bitki rejenerasyon sisteminde en iyi performans kaydedilmiştir. Bu elde edilen ön deneysel sonuçlar ışığında; çağdaş haploid teknolojisi ve genetik mühendisliği yaklaşımları için teknolojik bir temel sağlamak amacıyla, çavdarda hedeflenmiş bölgeye özgü mutasyonlar oluşturmak için RNA güdümlü Cas9 endonükleaz tabanlı genom düzenlemesi bu tez çalışması kapsamında uygulanmıştır. PLA1 geninde fonksiyon kaybının, mısır bitkisinde haploid indükleme kabiliyeti kazanmakla ilişkili olduğu daha önce gösterilmişti.Bu nedenle, gerçekleştirdiğimiz çalışmada Cas9 endonükleaz teknolojisini kullanarak hedeflenen mutagenez gerçekleştirmek için mısır FOSFOLİPAZ A1'in (PLA1) çavdar ortologunu ele aldık. Bu kapsamda; (Sc) PLA1 geninin 1, 2 ve 3 ekzonlarında dört hedef motif seçtik ve buna göre dört kılavuz RNA (gRNA) tasarladık. gRNA'ların yapısı ve tasarımı, çevrimiçi araçlar (RNA fold, WU-CRISPR ve Benchling) kullanılarak tasarlandı. Golden Gate klonlamasına dayalı CASCADE/Cas9 vektör dizilimi sistemi, çavdar transformasyonu için P6i binary vektöründe seçilen gRNA'ların ekspresyon kasetini klonlamak için kullanılmıştır. Cas9 ekspresyon kaseti, GFP seçim markörü ve gRNA'lar, tek bir golden gate PCR reaksiyonunda bir klonlama vektörüne bağlandı. ScPLA1 için yapılandırılmış vektörlerin fonksiyonel doğrulaması, çavdar protoplastlarının PEG aracılı transfeksiyonu kullanılarak gerçekleştirildi. İki genotip ve dört vektör protoplast transfeksiyonu için test edilmiştir. Konfokal mikroskopi altında sfGFP seçim markörü kullanılarak yapılan hesaplamada %75 transfeksiyon oranı elde edilmiştir. Mutasyona uğramış protoplastlardan DNA izole edilmiş ve hedeflenen kısmi gen fragmanları için PCR reaksiyonları yapılmıştır. Muhtemel mutasyon indüklenmesine işaret eden hedefe spesifik amplikonlar için çift bantlar içeren PCR sonuçları, dizileme analizi için saklanmıştır. Bu amplikonların dizilenmesinden elde edilecek sonuçların mutasyonları tam olarak belirlemesi beklenmektedir. Agrobacterium yoluyla stabil transformasyon, stabil transforme edilmiş çavdar bitkilerinde mutasyonun bir göstergesi olarak kullanılabilecek amplikon dizileme analizinden sonra yapılacaktır.
Özet (Çeviri)
Rye (Secale cereale L.) is a diploid winter/spring cereal plant which proved highly recalcitrant to biotechnological approaches. It is genetically and phenotypically highly versatile and the second most important crop to produce bread worldwide, while green plants are used as feed for livestock. In contrast to its high potential, haploid technology and genetic engineering have, as yet, not been playing a significant role in rye breeding programs. Rye genome has recently been published (March and October 2021), that made the applications of CRISPR-Cas9 based genome editing available. Callus formation and regeneration of shoots is highly dependent upon genotype and culture conditions, which are pre-requisites for genetic engineering. Inbred lines No5 and Lo7 (the latter representing the sequenced reference genome) showed the best performance in plant regeneration system in previous experiments. Taking advantage of this preliminary progress and to provide a technological basis for contemporary haploid technology and genetic engineering approaches, RNA-guided Cas9 endonuclease-based genome editing is applied to generate site-specific mutations in rye in context of this thesis study. The loss of function of the PLA1 gene was previously demonstrated to be sufficient to confer haploid-inducing capability in maize. Therefore, we addressed the rye orthologue of the maize PHOSPHOLIPASE A1 (PLA1) to perform targeted mutagenesis using Cas9 endonuclease technology. We selected four target motifs in exons 1, 2, and 3 of (Sc) PLA1 gene and designed four guide RNAs (gRNAs) accordingly. Structure and design of gRNAs was employed using online tools (RNA fold, WU-CRISPR and Benchling). CASCADE/Cas9 vector assembly system based on Golden Gate cloning was used to clone the expression cassette of the selected gRNAs in the P6i binary vector for rye transformation. Cas9 expression cassette, GFP selection marker and gRNAs were bound to an assembly vector in a single golden gate PCR reaction. Functional validation of constructed vectors for ScPLA1 was done using PEG-mediated transfection of rye protoplasts. Two genotypes and four vectors were tested for protoplast transfection and 75% transfection rate was observed using sfGFP as selection marker under confocal microscopy. DNA from mutated protoplasts was extracted and PCR reactions were performed for the targeted partial gene fragments. The PCR results containing double bands for the target specific amplicons, which indicate towards possible mutation induction, were stored for further sequencing analysis. The results to be obtained from sequencing of these amplicons are expected to exactly pinpoint the mutations. Stable transformation through Agrobacterium will be done after the analysis of amplicon sequencing which could be used as an indication of mutation in stably transformed rye plants.
Benzer Tezler
- Enerji ihtiyacının karşılanmasında doğalgaz ve rüzgâr kaynaklı enerji çevrim santralleri; yatımlar üzerine stratejik bir analiz
Natural gas and wind based cycle plant in supplying the needs of energy reguirement; a strategic analysis on investments
GÜVEN KARAMAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
İşletmeOrdu ÜniversitesiYenilenebilir Enerji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. KADİR AKSAY
- İşletmelerde finansal başarısızlık tahminlemesi ve Borsa İstanbul'da faaliyet gösteren gıda şirketlerinde uygulama
Financial distress forecasting in businesses and application in food companies operating in stock exchange Istanbul
KEREM URAL
- Orta doğu'da yeni stratejik çevreleme girişimlerinin Türk dış politikasına etkisi: Suriye örneği
The effects of strategic containment attempts in the middle east on turkish foreign policy: The example of Syria
OĞUZHAN ERGÜN
Doktora
Türkçe
2013
Kamu YönetimiDokuz Eylül ÜniversitesiKamu Yönetimi Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. AHMET NAZMİ ÜSTE
- İslâm'ın ik yıllarında (h.1-41/m.622-661) iskân
Settlement in early years of islam (ah.1-41/a.c.622-661)
TAHSİN KOÇYİĞİT
Doktora
Türkçe
2006
TarihDokuz Eylül Üniversitesiİslam Tarihi ve Sanatları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RIZA SAVAŞ
- Müslüman Kardeşler'in iktidar tecrübesi: Mısır örneği
Governing experience of the The Muslim Brotherhood: Egyptian example
CEMAL KAZAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Siyasal BilimlerSakarya ÜniversitesiOrtadoğu Araştırmaları Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUHAMMED MÜCAHİD DÜNDAR