Application of CRISPR /DCAS9 systems for increasing theexpression of FSH receptor in human granulosa cells
Insan granüloza hücrelerinde FSH reseptörünün ekspresyonunu arttırmak için CRISPR /DCAS-9 sistemlerinin uygulanmasi
- Tez No: 752506
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ SERÇİN KARAHÜSEYİNOĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Folikül, FSHR, Granüloza Hücresi, CRISPR/dcas9, Follicle, FSHR, Granulosa Cells, CRISPR/dcas9
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Üreme Biyolojisi Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 80
Özet
FSH, ovaryumda folikülogenezin desteklenmesi ve steroid hormonlarının üretimi için gereklidir. FSH'nın eksikliğinde foliküler gelişim durur. Granüloza hücrelerinde FSH' dan bağımsız büyümeden FSH' ya bağımlı büyümeye geçiş FSH reseptörünün (FSHR) bu hücrelerdeki anlatımına bağlıdır. CRISPR aktivasyonu, endonükleaz görevi bulunmayan bir CRISPR protein varyantı olan dCas9' un DNA'yı değiştirmeden genlere bağlanma yeteneğine dayanır. CRISPR aktivasyon (CRISPRa) sistemleri DNA' ya bağlanır ve gen anlatımını geliştirmek için transkripsiyon faktörlerini kullanır. CRISPRa stratejileri, füzyon proteinleri ve Cas sisteminin yeniden mühendisliği dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyonel aktivatörleri kullanır. SunTag, SAM ve VPR' nin tümü, ilk dCas9- VP64 tekniğine göre önemli gelişmeler göstermiştir; bu nedenle, çeşitli hücrelerdeki genleri aktive ederken seçilebilecek birkaç seçenek vardır. Araştırmamızın ana hedefi, insan granüloza hücre hattında (HGRC) FSH reseptörünin anlatımını artırmak için CRISPR dcas9 teknolojisinin kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek ve bu uygulamanın hücre içi yolaklardaki olası etkilerini incelemektir. dCas9 sisteminin FSHR' yi aktive edebildiğini ve artan FSH reseptör aktivitesinin steroidojenik, yaşamı sürdürme ve ölüm sinyalizasyonunda yer alan birkaç alt yolu etkilediği sonucuna ulaşılmıştır. İnsan granüloza hücrelerinde FSHR' yi etkinleştirmek için dcas9 sistemini kullandıktan sonra, FSHR, AKT, aromataz, MAPK8, MAPK1, ESR1, MTOR, p53, kaspaz 3' ün gen anlatımını önemli ölçüde arttığını gösterdik. vii FSHR ile ilgili proteinler incelendiğinde FSHR, AKT, aromataz ve p-38 MAPK' da protein seviyesinin yükseldiği de gözlendi. dcas9 ile aktive edilen FSHR' nin işlevselliği, follitropin alfa (Gonal-f) tedavisi kullanılarak test edildi. FSHR, AKT, aromataz, MAPK8, p53 ve kaspaz 3' ün gen anlatım seviyesinin bütün zamanlara bağlı olarak artması gösterilmişken, ESR1 ve MTOR' un gen anlatımının geçici olarak arttığı gösterilmiştir. Araştırmamızda, dcas9 teknolojisinin gen ve protein seviyelerinde FSHR' yi etkili bir şekilde artırmak için kullanılabileceği ortaya konmuştur. Genom düzenleme teknikleri kullanılarak arttırılmış FSH reseptörü, in-vitro oosit maturasyonunda, kadınlarda sık görülen FSH duyarlılığı sorunlarının araştırılmasında özellikle, polikistik over sendromu (PCOS), overin aşırı ve yetersiz duyarlılığı, kanser hastalarındaki çalışmalarda yardımcı olabilir.
Özet (Çeviri)
FSH (follicle-stimulating hormone) is necessary for the ovary to produce oocytes and the production of steroid hormones. Follicular development is arrested when FSH is not present. The change from FSH-independent to FSH-dependent growth in granulosa cells depends on FSHR (follicle-stimulating hormone receptor). CRISPR activation (CRISPRa) is based on the ability of dCas9, a CRISPR protein variant that cannot act as an endonuclease, to connect to genes without altering the DNA. CRISPRa systems bind to DNA and recruit transcription factors to enhance gene expression. CRISPRa strategies use a variety of transcriptional activators, including fusion proteins and Cas system reengineering. SunTag, SAM, and VPR have all shown significant improvements over the initial dCas9-VP64 technique; therefore, there are several options to choose from when activating genes in various cell lines. The objective of this research has been established to determine if CRISPR dcas9 technology could be used to increase FSH receptor expression in HGRC1 cells (human granulosa cell line) and to investigate the possible effects of dCas9 application on intracellular pathways . The results have indicated that, the dcas9 system can activate FSHR, and increased FSH receptor activity affects several fundamental cellular events involving steroidogenic, life-sustaining, and cell death related signalling sub-pathways. After using the dcas9 system to activate FSHR in human granulosa cells, we have demonstrated a significant increase in the gene expression profile of FSHR, AKT, aromatase, MAPK8, MAPK1, ESR1, MTOR, p53, caspase 3. The examination of FSHRrelated proteins has revealed that the protein levels of FSHR, AKT, aromatase, and p-38 MAPK have also increased. v The functionality of dcas9 activated FSHR was tested using follitropin alpha (Gonal-f). It has also been shown that although the gene expression levels of FSHR, AKT, aromatase, MAPK8, p53, and caspase 3 increased on a time-dependent manner, the increment in MAPK1, ESR1 (Estrogen Receptor1) and MTOR was temporary. The results of our research led us to conclude that dcas9 technology can be used to increase FSHR at the gene and protein levels efficiently. Genetically engineered granulosa cell for increased FSHR can be used as in vitro models to investigate in vitro maturation (IVM), FSH hyper/hyposensitivity, polycystic ovary syndrome (PCOS) and cancer studies.
Benzer Tezler
- Tümör tanı ve izlemi için dolaşımdaki serbest DNA'nın tayinine yönelik spesifik bir biyosensör sistemi geliştirilmesi
Development of A specific biosensor system for the determination of circulating free DNA for tumor diagnosis and monitoring
ZİHNİ ONUR UYGUN
Doktora
Türkçe
2020
BiyokimyaEge ÜniversitesiTıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FERHAN GİRGİN SAĞIN
- A novel tool for the identification of locus-specific chromatin proteins
Lokusa özgü kromatin proteinleri tamınlanması için yeni bir araç
ANNA OGMEN
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. NEŞET CEVDET TOLGA EMRE
- SK-MEL-30 hücre hattında NRAS geni Q61K mutasyonuna CRISPR/Cas9 tekniğinin uygulanması
Application of CRISPR/Cas9 technique to the nras gene Q61K mutation in SK-MEL-30 cell line
TUĞÇE DURAN
- SK-MEL-30 hücre hattında nras geni Q61K mutasyonuna CRISPR/Cas9 tekniğinin uygulanması
Application of CRISPR/Cas9 technique to the nras gene Q61K mutation in SK-MEL-30 cell line
TUĞÇE DURAN
- Doğal Streptococcus thermophilus izolatlarında CRISPR sistemlerinin belirlenmesi ve faj konakçı etkileşim analizi
Determination of CRISPR systems in natural Streptococcus thermophilus isolates and analysis of phage host interaction
ELİF COŞKUN DAĞGEÇEN
Doktora
Türkçe
2021
BiyoteknolojiKahramanmaraş Sütçü İmam ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSMAİL AKYOL
DR. ÖĞR. ÜYESİ SABAHATTİN CÖMERTPAY