Serin alkali proteaz enzimi üretimi için biyoproses geliştirilmesi
Bioprocess development for serine alkaline protease production
- Tez No: 76601
- Danışmanlar: PROF. DR. H. TUNÇER ÖZDAMAR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 1998
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ankara Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 270
Özet
Beş alt-programdan oluşan doktora çalışmasının birinci evresinde, serin alkali proteaz (SAP) için biyoteknolojik proses geliştirilmesi için önce üretim potansiyeli yüksek mikroorganizma seçilmesi gerektiğinden, taranan çok sayıda mikroorganizma arasından, tanımlanmış bir ortamda en fazla SAP üreten Bacillus licheniformis seçilmiştir. Araştırmanın ikinci alt-programında, B. licheniformis üretim potansiyelini artırmak için ortam tasarımı yapılmış ve en uygun pH, sıcaklık ile alternatif karbon, azot ve fosfat kaynaklan bulunduktan sonra pilot ölçekli biyoreaktörlerde oksijen aktarımı hızının (OAH) SAP aktivitesi ve derişimi üe nötral proteaz, amilaz, amino asitler ve organik asitler oluşumuna ve dağılımına etkisi oksijen aktarım (OA) karakteristikleri ile birlikte araştırılmıştır. Metabolik yolizi mühendisliği (MYM) analizi doktora çalışmasının üçüncü alt-araştırma programım oluşturmuş; hücreiçi tepkimeler stokiyometrik denklemleriyle birlikte araştırılarak 147 tepkimeden oluşan tepkime yolizleri belirlenmiş, 147 tepkimede yer alan 105 bileşik için kütle korunum denklemlerinden oluşan matematik model kurulmuş, son aşamada biyoreaktör deney verileri kullanılarak denklem sistemi çözülmüş ve B.licheniformis için hücreiçi tepkime yolizlerinin ve tepkime hızlarının bulunması, üretimde darboğazların belirlenmesi ve ortam tasarımının geliştirilmesi için bilgi üretimi amacıyla MYM analizleri yapılmıştır. Dördüncü alt-araştırma programında B.licheniformis SAP üretim potansiyelinin, verim ve seçimliliğin artırılması için üç alt programdan oluşan genetik mühendisliği (GM) araştırma programı ile B.ticheniformis'de SAP üretiminden sorumlu gen SubC önce pRS316 E.coli-yeast shuttle plasmide klonlanmış sonra da pHV1431 E.coli-BaciUus shuttle plasmide sub- klonlama yapılmış ve rekombinant DNA SubC+pHV1431 B.licheniformis'e aktarılarak rekombinant B.licheniformis elde edilmiştir. Doktora programının son aşamasında GM ve MYM araştırma güçlerinin entegrasyonu ile moleküler biyokimyasal reaksiyon mühendisliği yaklaşımıyla, moleküler genetik tekniklerle geliştirilen rekombinant B. licheniformis ve doğal B. licheniformis ile karşılaştırmak üretim yapılmış; üretimde ve metabolik yolizlerindeki farklılıklar bulunmuş ve tartışılmıştır. Tek karbon kaynağı ile tanımlanmış üretim otammda en uygun bileşimi (kg m-3): sitrik asit, 9.0; (NH4)2HPO 4, 4.714 ; KH2P04, 2 kullanılarak; biyoreaktör optimum işletme parametreleri pHo=7.6, T=37°C ve optimum oksijen aktarım koşullan Qo/VR =0.5 vvm, N= 750 dk-1 (A=500 U cm -3) olarak bulunmuştur. MYM analizi Qo/VR=1.0 vvm hava giriş hızı ve N= 150, 500 ve 750 dk-1 karıştırma hızlarında gerçekleştirilmiş; biyoproses süresince üç OAH'da da çoğalma ve SAP sentezi için tüm ana tepkime yolizlerinin aktif durumda olduğu; ancak OAH'daki artışla sitrat tüketim hızı ve ATP üretim hızının arttığı, bunun da yolizindeki akılan ve sonuçta SAP sentezin etkilediği bulunmuştur. SAP molekülünün yapısının %6.6'sını oluşturan Asn, üç OA koşulunda da ortama salgılanmamıştır. Asn alası en yüksek değerine Qo/VR=1 vvm N= 500 dk-1 orta OA koşullarında Evre IV'de ulaşmıştır. Sonuçlar ışığında SAP üretiminde, karbon kaynağı olarak sitrik asit kullanıldığında yetersiz Asn üretiminin, düşük asparajin sentetaz aktivitesi veya yüksek aspartat kinaz aktivitesi nedeniyle prosesin hız kısıtlayıcı basmaklarından biri olduğu sonucuna varılmıştır. Bu nedenle asparajin sentetaz veya aspartat kinaz enzimleri metabolik mühendisliği konumlan olarak belirlenmiştir.
Özet (Çeviri)
B.licheniformis that is an industrially important microorganism was selected among many species in a defined medium as producer of serine alkaline protease (SAP) enzyme. In the second phase, in order to increase production potential of B. licheniformis, bioprocess medium was designed and optimum pH, temperature, and alternative carbon, nitrogen, phosphate sources were determined; and the effects of oxygen transfer (OT) on SAP production on a defined medium with Cc =9.0 kg m- 3 citric acid as sole carbon source were investigated in 3.5 dm3 batch bioreactor systems. The concentrations of the product SAP and by-products, i.e. neutral protease, amylase, amino acids, and organic acids were determined in addition to SAP activities. Qo/VR =0.5 win, N= 750 min-1 oxygen transfer conditions was optimum for maximum SAP activity which was 500U cm'3 at t=37 h. The dynamic method was applied to find the oxygen uptake rate r0 and oxygen transfer coefficient KLa during the residence times corresponding to the characteristic regions of the batch bioprocess and models are developed in order to predict KLa and to. Further, in the third phase of the research for metabolic pathway engineering (MPE) analysis,a mass flux balance based stoichiometric model for B.licheniformis has been set up. The model considers 147 reaction fluxes, and there are 105 metabolites that are assumed to be in pseudo-steady state. The fluxes of the metabolic pathways through the central carbon pathways in the SAP fermentation were calculated by MPE analysis on the basis of the model using time profiles of citrate, dry cell, organic acids, amino acids and SAP. Metabolic pathway analysis was conducted at Qo/V=1.0 wm air flow rate, N= 150, 500 ve 750 min-1 agitation rate. At all OT conditions, in all periods of the fermentation, for growth and SAP synthesis the central pathways were active. Nevertheless, with the increase of oxygen transfer rate, citrate uptake rate and ATP generation increased and this affected all the pathways within the cell and this reflected to SAP production. In the view of metabolic pathway analysis results, Asparagine (Asn) -6.6 % of which is consisted in SAP- is the only amino acid that is not excreted to the fermentation broth at all oxygen transfer conditions is the rate limiting step in SAP synthesis, probably because of either low asparagine synthetase or high aspartate kinase activity that was influenced by oxygen transfer rate. In the fourth phase that is the genetic engineering (GE) research programme for developing recombinant B.licheniformis, SubC gene encoding SAP was amplified from the chromosal DNA of the wild type B.licheniformis by using PCR technology. SubC gene was first cloned in pRS316 E.coli-yeast shuttle plasmid, then sub- cloned to pHV1431 Kcoli-Bacillus shuttle vector, and transferred to B. licheniformis. Finally, GE work and MPE were converged in order to generate a deep understanding of biochemical reaction engineering at a molecular level for a more focused approach to the problems of yield, selectivity and productivity.
Benzer Tezler
- Rekombinant proteaz üretiminde biyoreaktör işletim parametrelerinin hücreiçi tepkime hızlarına ve verime etkisi
Effect of bioreactor operation parameters on intracellular reaction rates and yield in recombinant protease production
ESRA BİLİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2002
Kimya MühendisliğiAnkara ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR
DOÇ. DR. PINAR ÇALIK
- Alkali proteaz enzimi üretiminde oksijen aktarımının ürün verimine ve seçimliliğine etkisinin araştırılması
Investigation of oxygen transfer effects on the yield and selectivity of the production of protease enzymes
UĞUR SALGIN
- Recombinant therapeutic protease production by Bacillus sp.
Terapatik rekombinant proteaz streptokinazın Bacillus türleriyle üretimi
NURİYE KORKMAZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2007
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. PINAR ÇALIK
PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK
- Rekombinant bacillus subtilis hücreiçi tepkime sisteminin genom-seviyede araştırılması
Genome-scale investigation of recombinant bacillus subtilis intracellular reaction system
PINAR KOCABAŞ
Doktora
Türkçe
2017
Kimya MühendisliğiAnkara ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR
- Rekombinant bacillus sp. ile alkali proteaz üretimi için kompleks üretim ortamı tasarımı
Design of complex medium for alkaline protease production by recombinant bacillus sp.
MUZAFFERE YAĞIZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2000
Kimya MühendisliğiAnkara ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜZİDE ÇALIK