Nitrit biyosensörü geliştirilmesi için rekombinant nitrit redüktaz enzimi üretimi
Production of recombinant nitrite reductase enzyme for nitrite biosensor development
- Tez No: 794145
- Danışmanlar: PROF. DR. MELEK ÖZKAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Çevre Mühendisliği, Environmental Engineering
- Anahtar Kelimeler: Nitrit Redüktaz, Klonlama, Enzim Saflaştırma, Biyosensör, Nitrite Reductase Enzyme, Cloning, Enzyme Purification, Biosensor
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 73
Özet
Bu tez çalışmasında, nitrit ölçümünde kullanılacak bir biyosensör geliştirmek amacıyla biyoajan olarak görev yapacak olan nitrit redüktaz enzimine (NirB) ait gen klonlanmış, saflaştırılmış ve amperometrik biyosensör elektrodunda test edilmiştir. Escherichia coli (E. coli) NirB geni bir saflaştırma vektörü olan pET28a vektörüne polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılarak yerleştirilmiştir. Rekombinant vektör E. coli BL21 hücrelerine aktarıldıktan sonra elde edilen trasformant kolonilerden nitrit redüktaz B enzimi saflaştırılmıştır. Enzimin oksijen varlığında agrede olduğu ve betamerkaptoetanol varlığında indirgendiği ve aktif formuna kavuştuğu belirlenmiştir. Enzimin üretim şartları ve aktivitesi optimize edilmiş ve KM ve VMAX değerleri hesaplanmıştır. KM değeri 1.056 mM ve VMAX değeri 0.293 μmol/mg·dk'dır. Enzim aktivitesi nitritteki azalmanın Griess metodu kullanılarak ölçülmesi suretiyle belirlenmiştir. Enzimin spesifik aktivitesi 8.518 μmol/mg.protein.dk olarak hesaplanmıştır. Deney sonuçlarına göre enzim; pH 7.5 ve 37°C'de 5 dakikalık reaksiyon süresi ile en yüksek aktiviteyi göstermektedir ve 4°C'de saflaştırıldığı gün tetramere dönüşmesine izin vermeden βME eklenip saklandığında aktivitesini daha uzun süre koruduğu tespit edilmiştir. Aynı zamanda enzim 25mM kadminyum varlığında saklandığında, kadminyum iyonunun enzimi koruyarak aktivite kaybını engellediği gözlenmiştir. Sodyum nitrat ve sodyum format gibi iyonların yüksek konsantrasyonları ise enzimin aktivitesini düşürmektedir. Enzim poligluteraldehit ve pirol varlığında altın elektrot yüzeyine tutuklanarak amperometrik ortamda çalışan bir elektrot üretilmiştir. Biyosensörün artan nitrit konsantrasyonlarında (0.5mM ve 3.5mM) dönüşümlü voltametri (CV) grafiği kaydedilmiş ve enzimin amperometrik bir nitrit biyosensörü için uygun bir ajan olduğu gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
In this study, gene for nitrite reductase enzyme (NirB) which will serve as a bioagent to develop a biosensor to be used in nitrite measurement, was cloned, purified and tested in amperometric biosensor electrode. Escherichia coli (E. coli) nirB gene was cloned in the pET28a vector by amplifying with polymerase chain reaction (PCR). Nitrite reductase B enzyme was purified from the trasformant colonies obtained after the constructed vector was transferred to the E. coli BL21 cells. It has been determined that the enzyme was aggragated in the presence of oxygen and it was reduced in the presence of Beta mercaptoethanol and gains its active form. The production conditions and activity of the enzyme has been optimized and KM and VMAX values were calculated to be 1.056 Mm and 0.293 μmol/mg·min, respectively. The enzyme activity was determined by measurement of the decrease in nitrite concentration using the Griess Method. The specific activity of the enzyme was calculated as 8.518 μmol/mg.protein.min. Experiments related to the optimization showed that highest activity occured at 7.5 and 37°C with a 5 minute reaction time, and it was found that when the βME was added just after purification and enzyme stored at 4°C, it protected its activity for a longer period of time. At the same time, when the enzyme was stored in the presence of 25mM cadminium, it has been observed that the cadminum ion prevented loss of activity by preserving the enzyme. High concentrations of some ions such as sodium nitrate and sodium formate reduced the activity of the enzyme. For biosensor preparation the enzyme Nirb was immobilized with polygluteraldehyde and pyrole on gold electrode, and measurements were performed in an amperometric environment. The cyclic voltammetry (CV) was recorded with increasing nitrite concentrations (0.5mM and 3.5mM). The enzyme was shown to be a suitable agent for an amperometric nitrite biosensor fabrication.
Benzer Tezler
- Kitosan karbon nanotüp komposit matriksli amperometrik nitrit biyosensörü geliştirilmesi
Development of an amperometric nitrite biosensor with a chitosan-carbon nanotube composite matrix
AFRA GÜLSÜM DURAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyoteknolojiGebze Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MELEK ÖZKAN
- Amperometrik nitrat biyosensörlerinin geliştirilmesi
Developing of amperometric nitrate biosensors
ÖZLEM TERZİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2008
Çevre MühendisliğiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ELİF ERHAN
- Nitrik oksit sentaz aktivitesinin non-radyoaktif ölçümü: Biyosensör geliştirilmesi
Non-radioactive measurement of nitric oxide synthase activity : Development of a biosensor
ZEYNEP YILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyomühendislikEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GÜNAY YETİK ANACAK
DOÇ. DR. PINAR KARA KADAYIFCILAR
- Bazı ağır metal ve organik kirleticilerin laktat dehidrogenaz enzimi üzerindeki engelleyici etkilerinin belirlenmesi ve enzim inhibisyonuna dayalı biyosensör geliştirilmesi
Determination of inhibition effect of some heavy metals and organic pollutans on lactate dehydrogenase enzyme and biosensor development based on enzyme inhibition
İBRAHİM TAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2008
BiyoteknolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MELEK ÖZKAN
- Enzimatik biyoanalizlerin izlenmesine yönelik etkin elektrokimyasal yöntemlerin geliştirilmesi: Biyosentri-voltammetri ve nanoyapı temelli sistemler
Development effective electrochemical methods for following enzymatic bioanalysis: Biocentri-voltammetry and nanostructure based systems
SERDAR ÇEVİK
Doktora
Türkçe
2013
Bilim ve TeknolojiMuğla Sıtkı Koçman ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SUNA TİMUR
DOÇ. DR. ÜLKÜ ANIK