Geri Dön

Ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.)'da biyoteknolojik yöntemlerle çinko biyoyararlılığının artırılması

Increasing zinc bioavailability in bread wheat (Triticum aestivum L.) by biotechnological methods

PDF İndir

  1. Tez No: 816802
  2. Yazar: ESMA YİĞİDER
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MAHMUT SİNAN TAŞPINAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Ziraat, Biotechnology, Genetics, Agriculture
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Atatürk Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 136

Özet

Amaç: Ekonomik açıdan önemli bir tür olan ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.)'da, myo-inositol-1-fosfat sentaz (MIPS) gen bölgesinin CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracıyla nakavt edilmesinin amaçlandığı bu çalışmada fitik asit (PA) miktarının düşürülmesi ve çinko (Zn) biyoyararlanımının artırılması hedeflenmiştir. Ayrıca, araştırmada MIPS geninin susturulmasının inositol yolağında ilişkili inositol pentakisfosfat 2-kinaz (IPPK), myo-inositol 3- kinaz (MIK), inositol monofosfataz 3 (IMP) ve myo-inositol oksijenaz (MIOX) gibi diğer genlerin ifadesine olan etkisi belirlenmeye çalışılmıştır. Yöntem: MIPS gen bölgelerinin belirlenmesi biyoinformatik araçlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu bölgeler tasarlanıp plazmit içerisine aktarılmıştır. Daha sonra plazmit, elektrokompetan Agrobacterium içerisine aktarılmış ve koloni PCR ile pozitif bakteriler belirlenmiştir. Plazmiti taşıyan Agrobacterium hücreleri kanamisin içeren ortamda büyütülmüş ve endosperm destekli olgun embriyo kaynaklı buğday kallusları ile inoküle edilerek gen transformasyonu sağlanmıştır. Aday mutant bitkiler P35 S ve Cas9 primerleri ile plazmit varlığı açısından değerlendirilmiştir. Ardından mutant bitkiler, gen bölgeleri ile ilişkili hedef 1 ve hedef 2 primerleri ile çoğaltılarak Sanger dizileme yapılmıştır. Yine mutasyonların belirlenmesinde, T7 Endonükleaz I analizi kullanılmıştır. MIPS, IPPK, MIK, IMP ve MIOX genlerinin ifade analizleri qRT-PCR kullanılarak belirlenmiştir. Bulgular: Buğdayda olgun embriyo kültüründe Agrobacterium aracılı etkili bir gen aktarımı sağlanmıştır. Araştırmada 10 günlük kallus dokularının aktarım için uygun olduğu görülmüştür. Yine araştırmada, en yüksek genetik transformasyon etkinliği, OD 600 = 0,8 bakteri yoğunluğunun, inokülasyon ortamında asetosiringon (AS) dozu olarak 200 µl kullanılmasının ve inokülasyondan sonra kallusların MS ortamı + 200 µl AS içeren kağıt ortamında 25 °C'de 48 saat süreyle karanlıkta ko-kültivasyona alınmasından elde edilmiştir. Araştırma sonucunda PA yolağında yer alan MIPS geninde CRISPR/Cas9 sistemiyle mutasyon oluşturulan 21 adet T0 hattı elde edilmiş, bu hatlarda, hedeflenen iki bölgede delesyon, insersiyon ve nükleotit seviyesinde değişimler (transisyon ve transversiyon) tespit edilmiştir. MIPS geninin dört mutant bitkinin (T0-9, T0-12, T0-13 ve T0-21) tüm genomlarında mutasyona bağlı olarak aşağı yönde düzenlendiği görülmüştür. Ayrıca, MIPS geninin IPPK ve MIK genleriyle pozitif yönde ilişkisinin olduğu belirlenmiştir. Sonuç: Araştırmada, buğdayda olgun embriyo kültüründe yüksek verimli ve tekrarlanabilir bir transformasyon sistemi geliştirilmiş ve bu sistemin, CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenleme için başarıyla kullanılabileceği gösterilmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi ile MIPS geninde meydana gelen mutasyonlara sahip T0 bitkilerinin ileri generasyonlara kadar yetiştirilmesi ve tohumlarda bitki besin elementi ve PA içeriğinin belirlenerek Zn biyoyararlılığı bakımından ıslaha uygun hatların elde edilmesi önerilmektedir.

Özet (Çeviri)

Purpose: In this study, which aims to knockout the myo-inositol-1-phosphate synthase (MIPS) gene region in bread wheat (Triticum aestivum L.), an economically important species, using the CRISPR/Cas9 genome editing tool, the reduction of phytic acid (PA) content and the enhancement of zinc (Zn) bioavailability were targeted. Additionally, the effect of silencing the MIPS gene on the expression of other genes involved in the inositol pathway, such as inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPPK), myo-inositol 3-kinase (MIK), inositol monophosphatase 3 (IMP), and myo-inositol oxygenase (MIOX), was investigated in this research. Method: The identification of MIPS gene regions was performed using bioinformatics tools. These regions were designed and transferred into plasmids. Subsequently, the plasmids were transferred into electrocompetent Agrobacterium, and positive bacterial colonies were determined using colony PCR. Agrobacterium cells carrying the plasmid were cultured in a medium containing kanamycin and then inoculated with wheat callus derived from mature embryos supported by endosperm to facilitate gene transformation. Candidate mutant plants were evaluated for the presence of the plasmid using P35 S and Cas9 primers. Then, mutant plants were amplified using target 1 and target 2 primers specific to gene regions and subjected to Sanger sequencing. T7 Endonuclease I analysis was used to determine mutations. The expression analyses of MIPS, IPPK, MIK, IMP, and MIOX genes were determined using qRT-PCR. Findings: Effective gene transfer through Agrobacterium was achieved in wheat mature embryo culture. The study showed that 10-day-old callus tissues were suitable for transfer. Additionally, the highest genetic transformation efficiency was obtained by using an OD 600 =0.8 bacterial density, a dose of 200 µl acetosyringone (AS) in the inoculation medium, and co-cultivation of the calli in MS medium + 200 µl AS on filter paper in darkness at 25 °C for 48 hours after inoculation. As a result of the research, 21 T0 lines were obtained with mutations in the MIPS gene involved in the PA pathway using the CRISPR/Cas9 system. Deletions, insertions, and nucleotide-level changes (transitions and transversions) were detected in the targeted regions in these lines. It was observed that the MIPS gene was downregulated due to mutations in the genomes of four mutant plants (T0-9, T0-12, T0-13, and T0-21). Additionally, a positive correlation was found between the MIPS gene with the IPPK and MIK genes. Results: In the study, a highly efficient and reproducible transformation system was developed in wheat mature embryo culture, and it was demonstrated that this system can be successfully used for CRISPR/Cas9-based genome editing. It is suggested that T0 plants carrying mutations in the MIPS gene using the CRISPR/Cas9 system should be grown to subsequent generations, and the plant nutrient element and PA content in the seeds should be determined to obtain breeding lines suitable for improvement in terms of Zn bioavailability.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    282650

    Kışlık ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.)'da sarı pas hastalığına dayanıklılığın biyoteknolojik yöntemlerle incelenmesi

    Investigation of yellow rust disease resistance in winter type bread wheat (Triticum aestivum L.) using biotechnological methods

    ÖZGE KARAKAŞ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    Biyoteknolojiİstanbul Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AHU ALTINKUT UNCUOĞLU

    DOÇ. DR. FİLİZ GÜREL

  2. Tez No

    771636

    Buğday (Triticum aestivum L.)'da ribozomu inaktive eden tritin protein geninin klonlanması, bakteriyel ifadesi, saflaştırılması ve kabak sarı mozaik virüs (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)'üne karşı antiviral etkisi

    Cloning, bacterial expression, purification and the antiviral effect on Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) of tritin protein gene which is inactivating ribosome in wheat (Triticum aestivum L.)

    SERAP DEMİREL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyolojiVan Yüzüncü Yıl Üniversitesi

    Bitki Koruma Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MUSTAFA USTA

  3. Tez No

    860746

    Puccinella distans L. (Jacq). parl. bitkisinin rizosferinden ekstremofilik bakterilerin izolasyonu ve moleküler tanımlanması ile pgpr özelliğine sahip olanların biyokömür ortamında ekmeklik buğday (Triticum avestivum L.) gelişimi üzerine etkisi

    Isolation and molecular identification of extremophilic bacteria with pgpr characteristics from the rhizosphere of Puccinella distans L. (Jacq). parl., and their impact on the growth of bread wheat (Triticum aestivum L.) in a biochar

    NOYAN EKEN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyoteknolojiSelçuk Üniversitesi

    Toprak Bilimi ve Bitki Besleme Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ERDOĞAN EŞREF HAKKI

  4. Tez No

    541882

    Kuraklık stresi ve humik asitin ekmeklik buğdayda (Triticum aestivum L.) bazı genlerin mRNA ifade seviyeleri ve DNA konformasyon değişimlerine etkisi

    The effect of drought stress and humic acid on mRNA expression levels of some genes and DNA conformation changes in bread wheat (Triticum aestivum L.)

    ESRA ARSLAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyolojiAtatürk Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLERAY AĞAR

  5. Tez No

    430099

    Ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.)'da kuraklık stresi dayanıklılığı ile ilişkili dna markörlerin belirlenmesi

    Determination of dna based molecular markers associated with drought tolerans in wheat (Triticum aestivum L.)

    EMİNE AÇAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyolojiÇankırı Karatekin Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. TURGAY ÜNVER

Geri Dön