Ayçiçeği mildiyösü hastalığının tespiti için ilmiğe dayalı izotermal çoğaltma yönteminin optimizasyonu
Optimization of loop mediated isothermal amplification assay for sunflower mildew disease detection
- Tez No: 841362
- Danışmanlar: PROF. DR. NESLİHAN TURGUT KARA
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Ziraat, Biology, Biotechnology, Agriculture
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 103
Özet
Bitki hastalıkları Dünya genelinde tarımsal verimi doğrudan olumsuz etkileyen faktörlerin başında gelmektedir. Bitkilerde oldukça yüksek oranlarda verim kayıplarına sebebiyet veren bu hastalıklarla mücadele edilmediğinde yaşanacak tarımsal kayıp özellikle gıda tedariğinin sürdürülebilirliği için kritik öneme sahiptir. Ayçiçeği bitkilerinde ayçiçeği mildiyösü hastalığına neden olan Plasmopara halstedii dünya çapında önemli verim kayıplarına ve ekonomik zarara yol açan bir bitki patojenidir. Patojenin çevresel durumdaki değişikliklere karşı yüksek adaptasyon yeteneğinin bir sonucu olarak, ayçiçeği üretimi için ciddi bir tehdit olarak öne çıkmaktadır. Plasmopara halstedii'nin tespiti ayçiçeği hastalığını yönetmek ve yayılmasını önlemek için önem taşımaktadır. Patojeni tespit etmek için fizyolojik, mikroskobik inceleme yöntemleri, serolojik yöntemler ve moleküler tespit yöntemleri dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Ayçiçeği bitkilerinin patojenlere maruz kalmaları ile enfeksiyon semptomlarının gözlemlenmesi arasında uzun bir zaman aralığı olabilmektedir. Bu nedenle semptomlar oluşmadan daha erken evrelerde hastalığın teşhisi verim kayıplarının önüne geçebilmek için oldukça büyük önem taşımaktadır. Bitki hastalıkları ile mücadelenin ilk adımı olan hastalığın tespiti için bugüne kadar geliştirilmiş olan pek çok yöntem ve yaklaşım mevcuttur. Fakat mevcut yöntemlerin, kullanımları zor ve maliyetli cihazlara, yüksek tecrübeli ve eğitimli personele ve donanımlı bir laboratuvara ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle bu tez çalışmasında sahada kolay kullanım ve analize imkân sağlayan, daha basit ve düşük maliyetli yöntemlerin arazide potansiyel kullanımına dikkat çekilmektedir. Bu amaçla son yıllarda dikkat çeken bir yöntem olan izotermal amplifikasyona dayalı tespit yöntemi olan ilmiğe dayalı izotermal amplifikasyon yönteminin (LAMP) kullanımı hedeflenmiştir. Bu yöntem kullanılarak gerçekleştirilen analizler cihaz gereksinimini ortadan kaldırmakta hatta çıplak gözle dahi analizi mümkün kılmaktadır. LAMP diğer amplifikasyon metotları gibi herhangi bir sıcaklık döngüsüne ihtiyaç duymayarak sabit bir sıcaklıkta ürün oluşturan ve sonuçların kolay bir şekilde tespit edilebildiği bir yöntemdir. LAMP yöntemine özgü 4-6 primer hedef nükleik asit üzerinde 6-8 bölgeyi hedeflediğinden oldukça yüksek hassasiyete ve özgüllüğe sahiptir. Geliştirilen LAMP yönteminin başarısı uygun primerlerin tasarımı ve reaksiyon koşullarının optimize olmasına bağlıdır. Bu tez çalışmasında ekonomik değeri ve tüketimi Dünya çapında oldukça yüksek olan ayçiçeğinde mahsul verimini %100'e ulaşan kayıplara uğratan ayçiçeği mildiyösünün erken safhalarda tespiti için LAMP yöntemine özgü 6 adet primer dizisi tasarlandı ve en uygun reaksiyon koşulları için çeşitli optimizasyon çalışmaları gerçekleştirildi. Görünür ışıkta analize imkân sağlayan nötral kırmızı ile hidroksinaftanol mavisi indikatörleri ve floresan özellikte olan Thiazole Green ile SYBR Safe DNA Gel Stain başarılı bir şekilde yönteme dahil edildi. Kullanılan indikatörlerin ve floresan boyaların konsantrasyon optimizasyonları gerçekleştirildi ve sonuçlar agaroz jel elektroforezi kullanılarak doğrulandı. Tez kapsamında gerçekleştirilen çalışmalarda floresan boyaların dahil edildiği reaksiyonların UV ışık kaynağı altında başarılı bir şekilde analiz edilmesine ek olarak nicel sonuçlar sağlayan gerçek zamanlı analizleri de yapıldı. Geliştirilen bu yöntemin özgüllüğünün belirlenmesi için gerçekleştirilen çalışmalarda farklı türlere ait genomik DNA örnekleri kullanıldı. Çalışma sonucunda geliştirilen LAMP yönteminin P. halstedii patojenine spesifik olduğu tespit edildi. Gerçekleştirilen hassasiyet çalışmalarında ise yöntemin hassasiyeti 0.5 pg/µl olarak belirlendi. Yapılan bu tez çalışmasında P. hasltedii'nin tespiti LAMP yöntemi kullanılarak ilk kez gerçekleştirilmiştir. Böylece düşük maliyetle, arazi koşullarında kullanıma uygun ve kolay analiz imkânı sağlayan, yüksek hassasiyet ve özgüllükte optimize bir LAMP yöntemi geliştirilmiştir.
Özet (Çeviri)
Plant diseases are among the foremost factors worldwide that directly negatively affect agricultural productivity. Failure to combat these deseases, which can cause significant yield losses in plants, is especially critical for the sustainability of food supply. Plasmopara halstedii, which causes sunflower downy mildew in sunflower plants, is a plant pathogen that causes significant yield losses and economic damage worldwide. As a result of the high adaptability of the pathogen to changes in the environmental situation, it stands out as a serious threat to sunflower production. Detection of Plasmopara halstedii is important to manage sunflower disease and prevent its spread. Various methods are used to detect the pathogen, including physiological examination methods, serological methods, molecular detection methods and microscopic examinations. There can be a significant time gap between sunflower plants being exposed to pathogens and the observation of infection symptoms. For this reason, diagnosis of the disease in the early stages before symptoms occur is of great importance in order to prevent productivity losses. There are many methods and approaches developed to date to detect the disease, which is the first step in combating plant diseases. However, existing methods require devices that are difficult and costly to use, highly experienced and trained personnel, and a well-equipped laboratory. For this reason, this thesis study draws attention to the potential use of simpler and lower-cost methods in the field, which enable easy use and analysis in the field. For this purpose, it is aimed to use the loop-based isothermal amplification method (LAMP), which is a detection method based on isothermal amplification, which has attracted attention in recent years. Analyzes performed using this method eliminate the need for a device and even make analysis possible with the naked eye. LAMP, like other amplification methods, is a method that does not require any temperature cycles, produces products at a constant temperature, and the results can be easily determined. Since the 4-6 primers specific to the LAMP method target 6-8 regions on the target nucleic acid, it has very high sensitivity and specificity. The success of the developed LAMP method depends on the design of appropriate primers and optimization of reaction conditions. In this thesis study, 6 primer sequences specific to the LAMP method were designed for the early detection of sunflower downy mildew, which causes crop yield losses of up to 100% in sunflowers, whose economic value and consumption are quite high worldwide, and various optimization studies were carried out for the most suitable reaction conditions. Neutral red and hydroxynapthol blue indicators, which enable analysis in visible light, and fluorescent Thiazole Green and SYBR Safe DNA Gel Stain were successfully included in the method. Concentration optimizations of the used indicators and fluorescent dyes were performed and the results were confirmed using agarose gel electrophoresis. In the studies carried out within the scope of the thesis, in addition to the successful analysis of reactions involving fluorescent dyes under a UV light source, real-time analyzes that provided quantitative results were also performed. Genomic DNA samples from different species were used in the studies carried out to determine the specificity of this developed method. As a result of the study, it was determined that the developed LAMP method was specific for the P. halstedii pathogen. Sensitivity studies determined the method's sensitivity to be 0.5 pg/µl. This thesis work achieved the first detection of P. halstedii using the LAMP method. An optimized LAMP method with low cost, suitability for field conditions, easy analysis, high sensitivity, and specificity has been developed.
Benzer Tezler
- Ayçiçeği mildiyösü etmeni Plasmopara Halstedii (Farl.) Berl. & de Toni'nin Türkiye'deki ırklarının tespiti ve bazı ticari ayçiçeği çeşitlerinin bu ırklara karşı reaksiyonlarının belirlenmesi
Determination of the races of Plasmopara Halstedii (Farl.) Berl. & de Toni, the causal agent of sunflower downy mildew in Turkey and reactions of some commercial sunflower varieties against these races
ERÇİN OKSAL
- Mildiyö hastalığına karşı farklı tolerans derecelerindeki bazı ayçiçeği genotiplerinde tohum kökenli fungusların belirlenmesi
Determination of seed-borne fungi in some sunflower genotypes with different tolerance degree to downy Mildew disease
MUSTAFA ARAP
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
ZiraatNamık Kemal ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURAY ÖZER
- Ayçiçeği'nde mildiyö (köse) hastalığına dayanıklı genotiplerin moleküler markırlar kullanılarak belirlenmesi
Determination of mildew disase (plasmopara halstedii) resistant genotypes by using molecular markers in sunflower
EMRAH AKPINAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyomühendislikTrakya ÜniversitesiBiyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YALÇIN KAYA
- Ayçiçeğinde (Helianthus annuus L.) embriyo kültürü ile generasyon atlatma ve hızlı ıslah çalışmaları
Short breeding cycle studies and generation skip in sunflower (Helianthus annuus L.) with embryo culture
MEHMET YASİN TULUM
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyolojiMarmara ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YILDIZ AYDIN
PROF. DR. AHU ALTINKUT UNCUOĞLU
- Ayçiçeği mildiyösü (Plasmopara halstedii (Farlow) berl. et de toni) 'ne karşı dayanıklılık mekanizmasının incelenmesi üzerine çalışmalar
Investigations on resistance mechanism of sunflower against to downy mildew (Plasmopara halstedii (Farlow) berl. et de toni)
TUĞBA HİLAL KILIÇ
Doktora
Türkçe
2020
KimyaTekirdağ Namık Kemal ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURAY ÖZER