Investigation of the in vitro and in vivo effects of telomere-targeted new drug candidate compounds on different cancer cell lines
Telomer hedefli yeni ilaç adayı bileşiklerinin farklı kanser hücre hatlarında in vitro ve in vivo etkilerinin incelenmesi
- Tez No: 844297
- Danışmanlar: PROF. DR. ZELİHA GÜNNUR DİKMEN, DR. ÖĞR. ÜYESİ SERGEI M. GRYAZNOV
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Kanser, telomer, telomeraz, TIF (telomeric induced foci), DNA, ksenograft, singeneik, LC-MS/MS, APE1, PARP1, 8-OH-dG, Cancer, telomere, telomerase, TIF (telomeric induced foci), xenograft, syngeneic, LC-MS/MS, APE1, PARP1, 8-OH-dG
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 106
Özet
Kanser, heterojenitesi ve metastatik özelliklerinin yanı sıra tedavi edilebilirliğinin sınırlı oluşu ile küresel olarak önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Kanser hücreleri telomeraz enzimi aktivitesi ile telomerlerini uzatmakta ve hücre siklusundaki kontrol noktalarından kaçarak immortal özellik kazanmaktadır. Kanser hücrelerinin %95'inde telomeraz ekspresyonu varken normal somatik hücrelerde baskılanmış olması nedeniyle, son yıllarda telomeraz/telomer hedefli tedaviler umut vaat etmektedir. Kanser hücrelerinin heterojenitesi ve farklı telomer uzunluklarına sahip olması nedeniyle, uzun süreli anti-telomeraz tedavilere bağlı yan etkiler görülebilmektedir. Bu nedenle telomerik uzunluklardan bağımsız olarak kısa sürede etki edebilecek telomerleri hedef alan yeni moleküllere ihtiyaç vardır. Bu doktora tezi çalışması kapsamında, telomerik yapılara telomeraz tarafından eklenen ve telomerik DNA hasarına neden olarak genomik kararsızlığa ve hücre ölümüne yol açabilecek moleküllerin in vitro ve in vivo olarak test edilmesi amaçlanmıştır. Bu moleküller, MAIA (Chicago, USA) biyoteknoloji firması tarafından sentezlenmiş ve Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı'na gönderilmiştir. Bu ilaç adayı moleküller, farklı kanser hücre hatlarına [meme kanseri (MCF-7), küçük hücre dışı akciğer kanseri (A549), rahim ağzı kanseri (HeLa) ve kolon kanseri (HT29)] 9 farklı konsantrasyonda 96 saat süre ile uygulanmış, sitotoksisite MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) ile değerlendirilmiştir. Elde edilen EC50 sonuçları her bir hücre hattında 6-thio-dG ile karşılaştırılmış ve L6 olarak adlandırılan molekül 6-thio-dG'ye oranla daha düşük EC50 değeriyle yeni potansiyel ilaç adayı olarak belirlenmiştir. Farklı hücre hatlarının L6 molekülüne karşı verdikleri yanıtlar değerlendirilmiş ve L6 molekülüne en duyarlı hücre hattı olan HT29 kolon kanser hücreleri hedef hücre hattı olarak seçilmiştir. Telomeraz enzimi ile telomerik uçlara eklenen bu moleküllerin, telomerik uçlarda yarattığı DNA hasarı, TIF (Telomer induced foci) yöntemi ile konfokal mikroskop kullanılarak incelenmiştir. Bu yöntemde telomerik prob ve DNA hasarına özgü γH2AX Ab ile yapılan boyamaların kolokalizasyonu ile TIF odakları gösterilmiştir. TIF yöntemi sonuçları, L6 molekülünün oluşturduğu telomerik DNA hasarının kontrol grubu ve 6-thio-dG'ye göre istatistiksel olarak daha yüksek olduğunu göstermiştir. Global genomik hasar incelendiğinde 6-thio-dG ile L6 molekülünün eşit ölçüde global DNA hasarı oluşturduğu gözlemlenmiştir. Ek olarak, kullanılan adayı moleküllerin baz eksizyon onarımı (BER) yolu proteinlerinden Apürinik/Apirimidinik endonükleaz 1 (APE1) ve Poli(ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP1) üzerindeki etkileri ve DNA hasar ürünleri olan 8-hidroksi- 2'-deoksiguanozin (8-OH-dG), miktarları da sıvı kromatografi-yüksek rezolüsyonlu kütle spektrometre (LC-HR/MS) ve sıvı kromatografi-sıralı kütle spektrometre (LC-MS/MS) kullanılarak incelenmiştir. Buradan elde edilen sonuçlara göre L6 molekülü, HT29 hücrelerinde PARP1 ekspresyonunda artışa ve APE1 ekspresyonunda ise azalmaya neden olmaktadır. İn vitroda etkinliği gösterilen moleküllerin in vivo etkinliği CD1 nude fareler ve BALB/c üzerinde test edilmiştir. HT29 hücre hattı ile oluşturulan ksenograft modelde L6'nın optimal dozu 3 mg/kg ve tedavi süresi haftada 2 kere olmak üzere toplam 4 doz uygulama olarak belirlenmiştir. CT26 hücre hattı kullanılarak singeneik hayvan modeli oluşturulmuş, takiben L6 molekülü ile anti-PD-L1 kombinasyonel tedavisi uygulanmıştır. Hayvanlar sakrifiye edildikten sonra çıkarılan tümör dokularında flow-sitometre ile immünfenotipleme yapılmıştır. L6 molekülünün tümör boyutunda küçülmeye, Treg hücre miktarında azalmaya ve aktive CD8+ hücrelerinde artışa yol açtığı tespit edilmiştir.
Özet (Çeviri)
Cancer, characterized by its heterogeneity, metastatic character, and limited treatability, stands as a leading global cause of mortality. Cancer cells elongate their telomeres through the activity of the telomerase enzyme, thereby gaining immortality by evading control checkpoints in the cell cycle. The expression of telomerase is present in approximately 95% of cancer cells, while its activity is absent in somatic cells. Consequently, in recent years telomerase/telomere-targeted therapies have shown significant promise. Due to the heterogeneity of cancer cells and their varying telomere lengths, long-term anti-telomerase therapies can lead to adverse effects. Therefore, there is a need for novel molecules that can target telomeres, regardless of their telomeric lengths, and exhibit rapid efficacy. Within the scope of this doctoral thesis research, the objective was to investigate molecules added to telomeric structures by telomerase, which may induce genomic instability and cell death through telomeric DNA damage, both in vitro and in vivo. These molecules were synthesized by the MAIA biotechnology company (Chicago, USA) and delivered to the Department of Medical Biochemistry. The candidate drug molecules were tested on different cancer cell lines [breast cancer (MCF-7), non-small cell lung cancer (A549), cervical cancer (HeLa), and colon cancer (HT29)] at nine different concentrations for 96 hours, and cytotoxicity was assessed using the MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) assay. The obtained EC50 results were compared with 6-thio-dG in each cell line, and a molecule named“L6”was identified as a new potential drug candidate with a lower EC50 value compared to 6-thio-dG. The EC50 values of different cell lines to the L6 molecule were evaluated, and HT29 colon cancer cells, which exhibited the highest sensitivity to the L6 molecule, were selected as the target cell line. The DNA damage induced by these molecules at telomeric ends was assessed using the Telomere Induced Foci (TIF) method with confocal microscopy. In this method, co-localization of telomeric probes and staining with the γH2AX antibody specific to DNA damage was used to demonstrate TIF. The results obtained from the TIF method indicate that the telomeric DNA damage caused by the L6 molecule is statistically significant compared to the control group and 6-thio-dG. Additionally, an assessment of global genomic damage reveals that the L6 molecule and 6-thio-dG induce DNA damage to an equal extent. Furthermore, the effects of the candidate molecules on the base excision repair (BER) pathway proteins Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease-1 (APE1) and Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), as well as the quantities of DNA damage product 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OH-dG) was investigated liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) techniques. L6 promotes a significant downregulation in the expression levels of both PARP1 and APE1 in HT29 cells. The in vivo efficacy of L6 was evaluated both in CD1 nude mice and BALB/c mice. In the xenograft model established with the HT29 cell line, the optimal dosage of L6 was determined to be 3 mg/kg, administered in a total of 4 doses, with a treatment frequency of twice per week. A syngeneic animal model was generated using the CT26 cell line, followed by the administration of sequential therapy with the L6 molecule and anti-PD-L1. After the euthanize the animals, immunophenotyping was performed by flow-cytometry on excised tumor tissues. The results obtained indicate that the L6 molecule led to a reduction in tumor size, decrease in Treg cell count, and an increase in the activated CD8+ cells.
Benzer Tezler
- PGLA kimyasal yapısına sahip emilebilir cerrahi ipliğin etkilerinin in vitro ve in vivo olarak araştırılması
The investigation of in vitro and in vivo effects of absorbable suture with PGLA chemical structure
SALİH ERAT
Doktora
Türkçe
2024
Histoloji ve EmbriyolojiKırıkkale ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HAKAN KOCAMIŞ
- Investigation of in vitro and in vivo effects of ochratoxin a on autophagy and ubiquitin-proteasome system
Okratoksin a 'nın otofaji ve ubikitin-proteozom sistemi üzerindeki in vıtro ve in vıvo etkilerinin araştırılması
HAFİZE AYŞİN AKPINAR
Doktora
İngilizce
2018
BiyokimyaBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. İBRAHİM YAMAN
- Mangiferin ve paklitaksel kombinasyonunun ehrlich ascites carcinoma üzerine etkisinin in vitro ve in vivo yöntemlerle incelenmesi
In vivo and in vitro investigation of mangiferin and paclitaxel combination on ehrlich ascites carcinoma
AYÇA ÜVEZ
Doktora
Türkçe
2019
Histoloji ve Embriyolojiİstanbul Üniversitesi-CerrahpaşaHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ELİF İLKAY ARMUTAK
PROF. DR. ENGİN ULUKAYA
- Allıum tuncelıanum ekstraktının domates ve biberde önemli bazı patojenlere karşı kullanılma olanaklarının araştırılması
Investigation of allium tuncelianum extracts against some important pathogens in tomato and pepper
TUĞÇE ERGÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
ZiraatSüleyman Demirel ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HÜLYA ÖZGÖNEN ÖZKAYA
- Α-kimotripsin ile hazırlanan gümüş nanopartikülerin (Ag-CT) H2O2 ile indüklenmiş SH-SY5Y nöroblastoma hücre hatlarında oksidatif stres parametrelerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of silver nanoparticles (Ag-CT) prepared with α-chymothripsin on oxidative stress parameters in H2O2-induced SH-SY5Y neuroblastoma cell lines
RUMEYSA BAŞARAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyoteknolojiBingöl ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BÜLENT KAYA