Investigation of the effects of ATP13A2 mutations on intracellular iron accumulation
ATP13A2 mutasyonlarının hücre içi demir birikimine etkilerinin incelenmesi
- Tez No: 856768
- Danışmanlar: PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 87
Özet
Kufor-Rakeb Sendromu (KRS) erken başlangıçlı atipik Parkinson hastalığının bir şeklidir ve spastisite, demansi ve supranükleer bakış parezisi ile karakterizedir. KRS otozomal resesif bir hastalıktır ve ATP13A2 genindeki fonksiyon kaybı mutasyonu KRS'ye neden olabilir. ATP13A2 geni 1. kromozomda bulunur ve büyük bir transmembran proteinini kodlar. ATP13A2, P5-tipi ATPaz protein ailesine aittir ve esas olarak lizozomların ve geç endozomların zarlarında bulunur. Temel olarak üç fonksiyonel bölgesi vardır: ATPase bölgesi, nükleotit bağlanma bölgesi ve otofosforilayon bölgesi. ATP13A2, demirleri şelatlayabilen poliaminlerin taşıması sayesinde hücrelerde demir homeostazının korunmasına yardımcı olur. Bu fonksiyon nedeniyle, ATP13A2 mutasyonları hücrelerde demir birikimine neden olabilir. Demir birikiminin hücrelerde endoplazmik retikulum (ER) stresini tetikleyebilmesi nredeniyle bu biriken demir hücre ölümüyle sonuçlanabilir. Ancak hastaların manyetik rezonans görüntülerine göre, tüm ATP13A2 mutasyonlarının hastalarda demir birikimine neden olup olmadığı tartışmalıdır. Farklı tip ATP13A2 mutasyonlarına sahip hastaların bir kısmının MR görüntülerinde demir birikimi gözlemlenirken, diğer bir kısım hastanın MR görüntüsünde demir birikimine rastlanmamıştır. Ayrıca, demir birikimi ve mutasyon çeşidi arasında bir bağlantı da bulunmamaktadır. Bu tez çalışmasında, çerçeve kayması, delesyon ve yanlış anlam olmak üzere üç farklı homozigot ATP13A2 mutasyonlarının demir birikimi ve bu demir birikiminin hücre canlılığına etkileri araştırıldı. Bu mutasyonlar üç farklı akraba olmayan KRS hastasında saptandı. Çerçeve kaymasına neden olan mutasyon, hastalarda güdük protein oluşturacak mRNA üretimine neden olmaktadır ve yapılan önceki çalışmalar ile mRNA'sının nonsense-mediated decay (NMD) aracılı mekanizma ile degrade olduğu bilinmektedir. Delesyon mutasyonu ise, ATP13A2 proteinin otofosforilasyon bölgesine denk gelmektedir. DKTGT otofosforilayon motifinin hemen yanında bulunan iki amino asitin (Lösin ve Treonin) delesyonuna sebep olmaktadır. Ayrıca, otofosforilayon motifine ek olarak bu iki amino asitin de türler arasında korunmuş olduğu bilinmektedir. Yanlış anlam mutasyonu ise, 5. transmembrane bölgesine denk gelmektedir ve yine türler arasında korunmuş lösin amino asitinin prolin aminoasitine değişmesine neden olmaktadır. Transmembran bölgesine denk gelmesi nedeniyle, proteinin lokalizsyonunu etkileyebileceği ve yanlış lokalize olan ATP13A2 proteininin işlevini yerine getirememesine neden olabileceğinden dolayı demir birikime sebep olacağı düşünülmektedir. Farklı çerçeve kayması ve yanlış anlam mutasyonları ile yapılan çalışmalarda, hastaların magnetic rezonans görüntülemerinde bazal ganglialarında demir birikimi bazı hastalar için gözlenirken bazı hastalar için gözlenememiştir. Bu çalışmanın amacı ise, farklı ATP13A2 mutasyonları ile ilişkili demir birikimi hücresel düzeyde analiz edilmesidir ve varsa biriken hücresel demirlerin hücre ölümüne neden olup olmadığının araştırılmasıdır. Bu amaç doğrultusunda, hastalardan iğne biyopsisi ile doku örnekleri alınarak primer fibroblast hücre hatları oluşturulmuştur. Aynı işlem sağlıklı bir bireyden doku alınarak tekrarlandı ve sağlıklı bireyden elde edilen fibroblast hücreleri kontrol amaçlı kullanılmıştır. Fibroblast hücrelerine ek olarak, yabanıl tip veya mutant ATP13A2 proteinleri MCF7 hücrelerinde aşırı ifade edilerek, ATP13A2 mutasyonlarının spesifik etkisi araştırılmıştır. ATP13A2 proteinlerinin MCF7 hücrelerinde aşırı ifade edilebilmesi için, moleküler klonlama yöntemi ile wt-ATP13A2, FS-ATP13A2, del-ATP13A2 ve MS-ATP13A2 konstraktları elde edilmiştir. Moleküler klonlamada, yabanıl tip ATP13A2 cDNA'sının elde edilmesi için HEK293T hücrelerinden RNA izole edilmiştir ve cDNA'ya dönüştürülmüştür. Çerçeve kayması mutasyonunu içeren ATP13A2 cDNA'sı ise hasta hücrelerinin RNA'sından elde edilmiştir. Yabanıl tip ve çerçeve kayması mutasyonuna sahip ATP13A2 cDNA'ları tasarlanan primerler kullanılarak çoğaltılmıştır. Ardından, ilgili restriksiyon enzimleri kullanılarak, cDNA'lar ve vektör kesilmiştir. Kesilen insert ve vektörler, ligasyon reaksiyonu ile birleştirilerek wt-ATP13A2 ve FS-ATP13A2 konstraktları elde edilmiştir. Ardından, del-ATP13A2 ve MS-ATP13A2 konstraktları için yönlendirilmiş mutagenez metodu kullanılmıştır ve tasarlanan primerler aracılığı ile ilgili mutasyonlar yabanıl tip ATP13A2 sekansı içerisine entegre edilmiştir. Moleküler klonlama sonrasında, insert sekanslar Sanger sekanslama tekniği ile kontrol edilmiştir. Daha sonra uygulanacak yöntemler için, öncelikle fibroblast hücrelerinde ATP13A2 mRNA seviyeleri ve MCF7 hücrlerinde aşırı ifade edilmiş ATP13A2 proteinlerinin varlığı incelenmiştir. ATP13A2 mRNA seviyeleri kıyaslandığında, çerçeve kayması mutasyonuna sahip ATP13A2 mRNA seviyesinin kontrol ve diğer mutasyonlara sahip ATP13A2 mRNA seviyelerinden önemli ölçüde az olduğu gözlenmiştir. Çerçeve kayması mutasyonuna sahip ATP13A2 mRNA'sının NMD mekanizması ile degrade olması, çerçeve kayması mutasyonuna sahip fibroblastlardaki ATP13A2 mRNA'sının daha az gözlenmesini açıklamaktadır. Ardından, ATP13A2 proteinlerinin, MCF7 hücrelerinde aşırı ifade edilmesi kontrol edilmiştir. Bunun için, western blot ve immunocytochemistry (ICC) analizi kullanılmıştır. ATP13A2 proteinlerinin başarılı bir şekilde MCF7 hücrelerinden aşırı ifade edildiği doğrulanmıştır. Daha sonra, fibroblast ve MCF7 hücrelerinde demir birikimi gözlemlenmiştir. Bu amaç doğrultusunda, yabanıl tip veya mutant ATP13A2 proteinlerini aşırı eksprese eden MCF7 hücreleri, FeCl₃-6H₂O muamelesi sonrası kullanılırken, hasta fibroblastlarına FeCl₃-6H₂O uygulaması yapılmamıştır. Hasta fibroblastları, hücrelerde demir birikimine neden olabilecek ATP13A2 mutasyonlarını hali hazırda bulundurduğundan dolayı, hücrelerdeki demir birikimini gözlemlemek için daha fazla demir uygulamasına ihtiyaç olmadığı düşünülmüştür. Prusya mavisi boyama yöntemi ile hücrelerdeki demir iyonları tespit edilmiştir ve hücrelerde en fazla demir birikimine ATP13A2'nin çerçeve kayması ve delesyon mutasyonlarının neden olduğu görülmüştür. Bununla birlikte, yanlış anlamlı ATP13A2 proteini de, yabanıl tip ATP13A2 proteinlerini eksprese eden kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında demir birikimine katkıda bulunmuştur. Yapılan önceki çalışmılarımızda, demir birikiminin hücre ölümü ile sonuçlandığı bilindiğinden dolayı, hücrelerin farklı FeCl₃-6H₂O konstrasyonlarındaki hücre canlılığı farkları analiz edilmiştir. Hem MCF7 hücrelerinde hem de fibroblastlarda FS-ATP13A2 ve del-ATP13A2'yi eksprese eden hücrelerde en fazla hücre ölümü tespit edilmiştir. Ek olarak, MS-ATP13A2'nin eksprese edildiği hücrelerin canlılıkları da demir birikimine bağlı olarak azaldığı bulunmuştur. Sonuç olarak, ATP13A2'nin farklı tip mutasyonlarının hücrelerde demir birikimine katkıda bulunduğu ve bu demir birikimlerinin hücre ölümüne neden olduğu anlaşılmıştır. Ek olarak, yapılan incelemeler doğrultusunda, FS-ATP13A2 ve del-ATP13A2 proteinlerinin, MS-ATP13A2 proteinine kıyasla, hücrelerde daha fazla demir birikimine ve buna bağlı daha fazla hücre ölümüne neden olduğu bulunmuştur ve bu bulguların, hastalarda hastalığın başaldığı zaman ile tutarlı olduğu saptanmıştır. FS-ATP13A2 ve del-ATP13A2 mutasyonlarına sahip hastalarda hastalık yaklaşık olarak 10 yaşlarında ortaya çıkmıştır, MS-ATP13A2 mutasyonuna sahip hastada ise 40 yaşlarında ilk semptomlar görülmüştür. Ayrıca, yapılan araştırmalar sonucunda farklı ATP13A2 mutasyonlarının demir birikimine neden olduğu saptandığından dolayı, KRS'nin NBIA hastalık grubuna dahil edilmesi gerektiği düşünülmektedir.
Özet (Çeviri)
Kufor-Rakeb Syndrome (KRS), characterised by spasticity, dementia and supranuclear gaze paresis, is a form of early-onset atypical Parkinson's disease. Autosomal recessive and loss-of-function mutations in the ATP13A2 gene have been shown to cause KRS. The ATP13A2 gene is located on chromosome 1 and encodes a large transmembrane protein. ATP13A2 belongs to the P5 type ATPase protein family and is mainly located in the membranes of lysosomes and late endosomes. By transporting polyamines that can chelate iron, ATP13A2 is involved in maintaining iron homeostasis in cells. Because of this function, ATP13A2 mutations can lead to iron accumulation in cells. In addition, this accumulated iron can lead to cell death because iron deposition can induce endoplasmic reticulum (ER) stress in cells. However, it is controversial whether all ATP13A2 mutations cause iron deposition in patients based on their magnetic resonance images. In this study, ATP13A2-related iron deposition was analysed at the cellular level. Iron accumulation and its effects on cell viability were studied for three different ATP13A2 mutations, namely frameshift (FS), deletion (del) and missense (MS). These mutations were identified in three different KRS patients. To analyze the effects of these mutations, MCF7 cells overexpressing either wt or mutant ATP13A2 proteins (FS-ATP13A2, del-ATP13A2 and MS-ATP13A2) and primary fibroblasts from patients subjected to FeCl₃-6H₂O treatment were used. Iron ions were detected in the cells by Prussian blue staining and it was observed that frameshift and deletion mutations of ATP13A2 caused the most iron accumulation in the cells. However, missense ATP13A2 also contributed to iron deposition compared to control cells expressing wt ATP13A2 protein. On the other hand, iron accumulation is known to lead to cell death via the ER stress pathway. Therefore, cell viability was analysed for these three ATP13A2 mutations. Consistently, most cell death was detected in cells expressing FS-ATP13A2 and del-ATP13A2 in both MCF7 cells and fibroblasts. In addition, the viability of cells overexpressing MS-ATP13A2 was also decreased in association with the iron accumulation. This suggests that mutations in ATP13A2 contribute to iron accumulation in cells and that this iron accumulation can lead to cell death.
Benzer Tezler
- Investigation of the effect of ATP13A2 (PARK9) frameshift mutation on the protein function
ATP13A2 (PARK9) çerçeve kayması mutasyonunun protein fonksiyonuna etkisinin incelenmesi
KORAY KIRIMTAY
Doktora
İngilizce
2021
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Investigation of the effect of C-MYC transcription factoron transcriptional regulation of ATP13A2 gene
ATP13A2 geninin transkripsiyonel regülasyonunda C-MYCtranskripsiyon faktörünün etkisinin incelenmesi
ASLI BERİL TİRYAKİLER
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Taşkömürünün yağ aglomerasyonu ile zenginleştirilmesinde bazı işletme parametrelerinin etkisinin incelenmesi
Investigation of the effects of some operating parameters with the benefication of oil agglomeration of hardcoals
SELMA ŞİMŞEK
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
Maden Mühendisliği ve MadencilikCumhuriyet ÜniversitesiMaden Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. YAKUP CEBECİ
- Yüksek karbonlu çeliklerin süperplastikliği üzerine alaşım elementlerinin etkisinin araştırılması
Investigation of the effects of alloying elements on the superplasticity of high carbon steels
BÜLENT KURT
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
Eğitim ve ÖğretimFırat ÜniversitesiMetalurji Eğitimi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. M. MUSTAFA YILDIRIM
- Titanyum dioksitin fare ince bağırsak mukoza epiteli hücrelerine etkilerinin elektron mikroskopla incelenmesi
Investigation of the effects of titanium dioxide on the mucosa epithelial cells of small intestine of mice by electron misroscope
ABDULLAH MELEKOĞLU