Geri Dön

Engineering a novel CYP119 with high biocatalytic efficiency by optimization of protein interactions and electron transfer

Protein etkileşimlerinin ve elektron transferinin optimizasyonu yoluyla yüksek biyokatalitik verime sahip yeni bir CYP119 mühendisliği

  1. Tez No: 896776
  2. Yazar: AKBOTA KAKIMOVA
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. NUR BAŞAK SÜRMELİ ERALTUĞ, DOÇ. DR. SİNAN GÜVEN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü
  10. Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyomühendislik Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 161

Özet

Sitokrom P450 enzimleri, birçok biyoteknolojik uygulama için mükemmel bir seçimdir. P450 sistemlerinin daha geniş uygulamalarını sınırlayan çeşitli zaafları vardır; redoks partner proteinleri yoluyla NAD(P)H'den elektron transferine duyulan ihtiyaç nedeniyle bu sistemlerin karmaşıklığı, NAD(P)H oksidasyonu ile ürün oluşumu arasındaki kopukluk gibi. Yüksek aktiviteye sahip rekombinant P450 enzim sistemleri, optimum redoks partnerleri seçilerek, bölgeye yönelik mutajenez kullanılarak veya farklı redoks ortakları denenerek elde edilebilir. P450'ler arasında ısıya dayanıklı asidotermofilik Sulfolobus acidocaldarius arkesinden elde edilen CYP119 enziminin biyokatalizör olarak potansiyeli yüksektir. Bu çalışmada, elektron transfer partneri, putidaredoxin (Pdx) ve termofilik CYP119 enzimi arasındaki protein-protein etkileşim incelenmiş ve rasyonel tasarımla elektron transfer verimliliği iyileştirilmiştir. On dört çeşit mutantlar tasarımı, PyRosetta Yazılımı kullanılarak, Rosie Docking Server ile docking yapıldı. Elde edilen sonuçlara göre, deneysel işlemler için N34E, D77R, N34E-D77R mutasyonları seçildi. CYP119 ve N34E, N34E-D77R ve D77R mutantların laurık asitle bağlanmasının ayrışma sabitleri (Kd) fark spektroskopisi ile 19 µM, 35 µM, 23 µM ve 87 µM olarak belirlendi. CYP119 için Pdx bağlanmasına ilişkin literaturde bildirilen Kd değeri 2100 µM. CYP119 ve N34E, N34E-D77R ve D77R mutantların Pdx ile bağlanmasının fark spektroskopisi ayrışma sabitleri ise 2440 µM, 112 µM, 200 µM ve 797 µM değerleri olarak gözlemledi. Böylece N34E mutasyonunda elektron transfer hızı 21 kat, N34E-D77R mutasyonunda ise 12 kat artıyor. D77R mutasyonu Koo (2002) tarafından önerildigi gibi bağlanmada yaklaşık 4 kat artışı doğruladı. Bu sonuçlar N34E ve N34E-D77R mutasyonlarının Pdx'e daha yüksek afiniteyle bağlandığına dair doğrudan kanıt sağlar. Bu CYP119-Pdx-PdR sisteminde elektron transfer hızında artış sağlar.

Özet (Çeviri)

Cytochrome P450s are the perfect choice for many biotechnological applications. The requirement for costly electron donors (NAD(P)H), redox partners, and uncoupling, the process of formation of reactive oxygen species instead of desired products, are limitations of P450s' extensive utilization. By selecting the best redox partners, and utilizing site-directed mutagenesis to improve protein-protein interaction, a novel P450 enzyme with increased activity can be obtained. Thermophilic CYP119 obtained from Sulfolobus acidocaldarius has a high potential as biocatalyst. In the current research, protein-protein interaction between electron transfer partner of P450cam, putidaredoxin (Pdx) and CYP119 was examined and their electron transfer efficiency was improved by rational design. Using PyRosetta Software, 14 mutants were created, using Rosie Docking Server, docking analysis were performed. The best models, N34E, D77R and N34E-D77R mutations were performed with site-directed mutagenesis method. Difference spectroscopy of substrate (lauric acid) binding to WT and mutant CYP119 revealed Kd values of 19 µM, 35 µM, 23 µM and 87 µM in WT CYP119, N34E, N34E-D77R and D77R mutant, respectively. The reported Kd for Pdx binding for WT is 2100 µM. Difference spectra of Pdx binding to WT CYP119 and mutants were followed to obtain dissociation constants. The observed Kd values for WT CYP119 and N34E, D77R, N34E-D77R mutants were 2390 µM, 112 µM, 797 µM and 200 µM, respectively. These outcomes offer solid evidence that the N34E, N34E-D77R mutants bind to Pdx with higher affinity, thus, showing an increase in electron-transfer rate for 21-fold in N34E and 12-fold N34E-D77R mutation in CYP119-Pdx-PdR system.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    793419

    Quantum advances in imaging systems

    Başlık çevirisi yok

    HASHIR PUTHIYAPURAYIL KUNIYIL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Fizik ve Fizik MühendisliğiÖzyeğin Üniversitesi

    Elektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ KADİR DURAK

  2. Tez No

    775982

    Engineering of a novel 3-dimensional glioblastoma cell culture system

    Yeni bir 3 boyutlu glioblastoma hücre kültürü sisteminin geliştirilmesi

    MERYEM DAMLA ÖZDEMİR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyomühendislikAdana Alparslan Türkeş Bilim Ve Teknoloji Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. DİLEK GÖKTÜRK

    PROF. DR. GÖZDE BAYDEMİR PEŞİNT

  3. Tez No

    284652

    Karbohidrat temelli doku iskelelerinin tasarlanması ve mezenkimal kök hücre kültüründe kullanılması

    Designing of carbohydrate based tissue scaffolds and their use in mesencymal stem cell culture

    BURCU KUTLUCA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    BiyomühendislikHacettepe Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE KEVSER ÖZDEN

  4. Tez No

    489447

    Metabolic engineering with a novel promoter in Pichia pastoris for recombinant human growth hormone production: Effects of oxygen transfer conditions

    Rekombinant insan büyüme hormonu üretimi için yeni bir promotor ile Pichia pastoris'te metabolik mühendislik tasarımları: Oksijen aktarım koşullarının etkisi

    ÖZGE KALENDER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

  5. Tez No

    463648

    Biochemical and genetic assessment of high value lipid production from local thermo-resistant green microalgae strain

    Isıl dirençli yerel yeşil mikroalg suşundan yüksek değerli lipit üretiminin biyokimyasal ve genetik açılardan değerlendirilmesi

    DİLAN AKIN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE MERAL YÜCEL

    YRD. DOÇ. DR. ÇAĞLA SÖNMEZ

Geri Dön