Geri Dön

Targeting and activation of antigen specific CD8+ T cells with peptide-major histocompatibility complex I tetramers

Peptit-majör histokompatibilite kompleks I tetramerleri ile antijen spesifik CD8+ T hücrelerin hedeflenmesi ve aktivasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 949414
  2. Yazar: ŞAFAK CEREN USLU ŞIVGIN
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. HANDE CANPINAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Moleküler Tıp, Onkoloji, Biotechnology, Molecular Medicine, Oncology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 133

Özet

T lymphocytes are key players in immune defense, recognizing tumor or infected cells through T-cell receptors (TCRs) that bind peptide–MHC (pMHC) complexes. However, this interaction is often too weak for effective detection of antigen-specific T cells. To enhance binding avidity, multimeric pMHC molecules are used, but traditional tetramerization strategies may miss TCRs recognizing low-stability yet immunogenic peptides. Moreover, in vivo use is limited by the need to engineer new pMHC constructs for each peptide, posing time and cost challenges. This thesis introduces a modular strategy using sortase-mediated ligation and azide–alkyne click chemistry to generate stable pMHC complexes. An azide group was added to β2-microglobulin near the peptide-binding cleft, and peptides with a poly-glycine spacer and alkyne group were covalently linked. The resulting complexes showed high TCR binding and stability for over three months at 4 °C without free peptide. This system notably stabilized SIINYEKL, a weak MHC binder. Additionally, costimulatory dimeric pMHC constructs were developed using nanobody technology and mammalian expression. While structurally successful, these constructs did not promote expected T cell proliferation. Further optimization is needed. Overall, this work presents a flexible platform for detecting and activating antigen-specific T cells with potential in personalized immunotherapy.

Özet (Çeviri)

T lenfositleri, bağışıklık sisteminin tümörlere ve enfekte hücrelere karşı yanıtında kritik rol oynar. Hedeflerini, T hücre reseptörlerinin (TCR) peptit–MHC (pMHC) komplekslerine bağlanması yoluyla tanırlar. Ancak bu etkileşim genellikle zayıftır ve antijen-spesifik T hücrelerinin etkin şekilde tespit edilmesini engeller. Bu sorunu aşmak için multimerik pMHC yapıları kullanılsa da geleneksel tetramerizasyon yöntemleri düşük stabiliteli ancak immünojenik peptitleri tanıyan TCR'leri kaçırabilir. Ayrıca her peptit için ayrı pMHC üretimi, in vivo uygulamalarda zaman ve maliyet açısından sınırlayıcıdır. Bu tezde, sortaz ligasyonu ve azid–alkin click kimyasıyla stabil ve modüler pMHC kompleksleri geliştirilmiştir. β2-mikroglobuline azid grubu eklenmiş; C-terminalinde alkin içeren peptitlerle kovalent bağlanarak uzun süre dayanıklı yapılar elde edilmiştir. Bu sistemle, MHC'ye zayıf bağlanan SIINYEKL peptidinin sunumu da güçlendirilmiştir. Ayrıca, kostimülatör içeren dimerik pMHC yapıları nanobody teknolojisiyle oluşturulmuştur. Yapılar başarılı şekilde üretildiyse de T hücresi proliferasyonu beklenen düzeye ulaşmamıştır. Bu sistem, antijen-spesifik T hücrelerinin tanımlanması ve hedeflenmesi için yenilikçi bir platform sunmaktadır. CD8+ T hücreleri, özellikle antitümör bağışıklık yanıtlarının oluşumunda konak savunmasında kritik bir rol üstlenmektedir. Etkili bir antitümör immün yanıtın gelişebilmesi için, öncelikle tümör hücrelerinde ekspresse edilen antijenlerin dendritik hücreler tarafından alınarak işlenmesi ve MHC molekülleri üzerinde sunulması, ardından bu dendritik hücrelerin lenfoid organlarda taşıdıkları antijenleri peptit-MHC (pMHC) kompleksi aracılığıyla T lenfositlere sunması ve T hücrelerinin T hücre reseptörleri (TCR) ile bu antijenleri tanıyarak aktive olması, son aşamada ise aktive olan T hücrelerinin tümör mikro çevresine göç ederek tanıdıkları antijene özgü bir immün yanıt oluşturmaları gereklidir (1). İmmünoterapiler, bireyin kendi bağışıklık sistemini destekleyerek veya modifiye ederek kanserle mücadele etmeyi amaçlamakta olup, son yıllarda bu alanda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, tedaviye verilen yanıtın hastalar arasında değişkenlik göstermesi, zamanla tedaviye karşı direnç gelişimi ve ciddi yan etkilerin ortaya çıkması gibi önemli sorunlar varlığını sürdürmektedir. CD8+ sitotoksik T hücreleri, antitümör immün yanıtın temel efektör hücreleri olmaları nedeniyle immünoterapi yaklaşımlarında öncelikli bir hedef olarak değerlendirilmektedir. Sitotoksik T hücre yanıtını desteklemeye yönelik immün kontrol noktası inhibitörleri, çeşitli kanser türlerinde umut verici sonuçlar elde etmiş olmakla birlikte (2–5), bu ajanların tümör-spesifik T hücrelerin yanı sıra sağlıklı dokulardaki T hücreleri üzerinde de etkili olması ciddi advers etkilerin ortaya çıkmasına yol açabilmektedir (6). Tümör hücrelerinde B7/CTLA-4 ve PD-1/PD-L1 gibi immün kontrol noktası moleküllerinin aşırı ekspresyonu, T hücre yanıtını baskılayarak antitümör bağışıklığın etkinliğini azaltmaktadır. İmmün kontrol noktası inhibitörleri bu reseptör-ligand etkileşimlerini engelleyerek T hücrelerinin efektör fonksiyonlarını artırmakta ve antitümör immün yanıtı güçlendirmektedir. Ancak ideal bir yaklaşım, yalnızca tümör antijenine özgü sitotoksik T hücrelerini hedefleyip aktive eden sistemlerin geliştirilmesiyle sağlanabilir. Altman ve arkadaşları tarafından 1996 yılında geliştirilen pMHC tetramer teknolojisi, antijen-spesifik T hücrelerinin doğrudan tespit edilmesine olanak sağlamıştır (7). UV ışığı veya sıcaklık değişimine duyarlı peptit değişim teknolojileri kullanılarak geniş pMHC kütüphanelerinin oluşturulması mümkün hale gelmiştir (7–10). Yine de bu teknolojiler yüksek stabiliteye sahip peptitlere gereksinim duymakta olup, düşük stabiliteli peptitlerin kullanımında ciddi sınırlamalar mevcuttur (11). Son yıllarda, disülfid köprüsü ile stabilize edilmiş MHC-I molekülleri ve DNA barkodlu pMHC tetramer teknolojileri gibi önemli ilerlemeler kaydedilmiştir (12). Yapılan çalışmalar, immünojenik peptitlerin MHC oluklarında daha yüksek stabilite gösterdiğini ortaya koymuş (17), ancak immünojenik peptitler arasında da geniş bir stabilite aralığının bulunduğu belirlenmiştir (18,19). Bu nedenle, düşük stabiliteli immünojenik pMHC komplekslerini tanıyabilmek amacıyla peptitlerin MHC içerisindeki stabilitesinin artırılması kritik bir gereklilik haline gelmiştir. Bu amaçla, peptid-β2m-HLA tek zincirli trimer proteinleri ve β2m ile füzyon peptitleri gibi yapılar geliştirilmiştir (13–15,20,21). Ancak bu yöntemlerin her bir peptit için ayrı genetik modifikasyon gerektirmesi, uygulamada ciddi bir dezavantaj oluşturmaktadır. Bu çalışmada, söz konusu sınırlamaları aşmak amacıyla pMHC molekülünün stabilitesini artırmaya yönelik yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu kapsamda, peptitin β2m'nin N-terminaline klik kimyasal tepkimesi aracılığıyla bağlanmasının, peptitin oluk dışına çıktığında yeniden MHC oluğuna girişini kolaylaştıracağı hipotezi oluşturulmuştur. Sortaz teknolojisi kullanılarak β2m'nin N-terminaline azid grubu, peptitin C-terminaline ise çoklu glisin bağlantılı alkin grubu eklenmiş ve gerçekleştirilen azid-alkin klik reaksiyonu sayesinde peptit MHC molekülüne sabitlenmiştir (22,23). Böylece, klasik pMHC-TCR etkileşimlerinden farklı olarak, peptitin yeniden MHC oluğuna girişinde çözeltideki serbest peptit konsantrasyonuna bağımlılık ortadan kaldırılmıştır. Ayrıca, farklı antijenler ve modülatör molekülleri birleştirerek antijen-spesifik CD8+ T hücrelerini in vivo hedefleyip aktive etmeye yönelik esnek bir platform geliştirilmiştir. Bu platform, TCR'yi hedefleyen pMHC molekülü, T hücrelerinde aktivasyonu sağlayacak modülatör bölge (örneğin IL-2 veya 41BB gibi moleküller) ve pMHC ağır zincirine eklenen 6E etiketi ile VHH05-CH3-modülatör dimeri arasında köprü kuran sistem olmak üzere üç ana bileşenden oluşmaktadır. Bu yaklaşım, her yeni peptit antijeni için ayrı bir genetik modifikasyon gerektirmediği için geniş bir TCR çeşitliliğini hedefleme potansiyeline sahiptir. MHC, T lenfositlerinin antijeni tanırken bağlandığı molekülleri kodlayan, birbirine yakın gen lokuslarından oluşan bir gruptur. 20. yüzyılın başlarında Loeb ve Tyzzer'in fareler üzerinde yaptığı çalışmalar, tümör gelişimine karşı direncin birkaç baskın gen tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. Singenik farelere yapılan tümör nakilleri başarılı olurken, allojenik farelerde reddedilmiştir. Çiftleştirme deneyleri, tümör direncinde en az 15 genin rol oynadığını ortaya koymuştur (24). 1936'da Gorer, fare eritrositlerinde farklı in-bred suşlar arasında değişiklik gösteren antijenik yapılar (Antijen II) bulunduğunu ve bu yapıların tümör nakil reddiyle ilişkili olduğunu göstermiştir (25). 1944'te Medawar, doku nakli reddinin tümörlere özgü olmadığını, normal dokular için de geçerli olduğunu göstermiş ve bu çalışmasıyla 1960 yılında Nobel Ödülü almıştır (26). 1948'de Gorer, Lyman ve George Snell; Antijen II'nin tümör nakil reddinde anahtar rol oynadığını ve bu antijenin genetik olarak H-2 lokusu ile kontrol edildiğini ortaya koymuştur (27). Snell, H-2 geninin majör doku uygunluk antijen sistemi olarak tanımlanmasına öncülük etmiştir. Ayrıca majör (H-2 gibi) ve minör (daha zayıf bağışıklık yanıtı oluşturan) doku uygunluk genlerini ayırmıştır (24). İnsanlarda ilk MHC antijeni 1958 yılında Jean Dausset tarafından keşfedilmiş ve başlangıçta“MAC”olarak adlandırılmıştır; daha sonra bu antijen HLA-A2 olarak isimlendirilmiştir (28). Aynı yıl, Rose Payne (29) ve Jon van Rood (30), hamile kadınların serumlarında anti-lökosit antikorlarının varlığını raporlamışlardır. 1960'lı yıllarda Baruj Benacerraf ve Hugh McDevitt, MHC genlerinin sadece antijen tanımaktan sorumlu olmadığını, aynı zamanda bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde de görev aldığını göstermiştir (31,32). Bu keşifler sonucunda Baruj Benacerraf, Jean Dausset ve George D. Snell 1980 yılında Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'ne layık görülmüştür (33). 1974 yılında Peter Doherty ve Rolf Zinkernagel, viral enfekte hücrelerin CD8+ T hücreleri tarafından tanınmasında MHC sınıf I moleküllerinin kritik rolünü keşfetmiş ve“MHC kısıtlaması”kavramını ileri sürmüşlerdir (34,35). Bu buluşları onlara 1996 yılında Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nü kazandırmıştır (36). MHC gen bölgesi, iki ana polimorfik gen sınıfı (sınıf I ve sınıf II MHC genleri) ve birkaç non-polimorfik gen içermektedir. Bu sınıf I ve sınıf II MHC genleri, memeli genomları içinde en yüksek polimorfizme sahip dizilerdir. Her birey, MHC genlerini her iki ebeveynden kodominant olarak ifade eder (37). Farelerde MHC gen bölgesi, yaklaşık 2000 kilo baz DNA içermekte ve 17. kromozom üzerinde yer almaktadır. Üç adet sınıf I MHC geni (H-2K, H-2D ve H-2L) bulunmakta olup, sırasıyla K, D ve L isimli üç farklı MHC sınıf I proteini kodlarlar. İki adet sınıf II MHC geni (I-A ve I-E) vardır ve bu genler I-A ve I-E isimli MHC sınıf II proteinlerini kodlamaktadır. Fare MHC alelleri, keşfedildikleri fare soyuna göre küçük harflerle gösterilir (örneğin, H-2b, H-2k gibi) (1). İnsanlarda MHC gen bölgesi, 6. kromozomun kısa kolunda (6p21.3) yer almakta olup yaklaşık 3,8 milyon baz çifti (Mb) DNA içermektedir (38). Bu bölge, insan genomundaki en yoğun gen bölgelerinden biridir ve 158 protein kodlayan gen ile 86 fonksiyonu bilinmeyen psödo gen içermektedir (39). İnsan MHC bölgesi üç ana bölüme ayrılmıştır: sınıf I, sınıf II ve sınıf III bölgeleri. Sınıf I bölgesi, üç klasik insan MHC sınıf I genini (HLA-A, HLA-B ve HLA-C) içerir ve bu genler sırasıyla kendi isimlerini taşıyan proteinleri kodlar. Ayrıca sınıf I ilişkili genler (MICA, MICB), klasik olmayan sınıf I genler (HLA-E, HLA-F, HLA-G) ve dört psödo gen (HLA-H, HLA-K, HLA-J, HLA-L) de burada bulunur. İnsan sınıf II bölgesinde HLA-DP, HLA-DQ ve HLA-DR genleri yer almakta olup, bu genler hem α hem β zincirlerini kodlayan alt genler içerir. Örneğin, HLA-DP geninin DPA1 ve DPB1 alt genleri bulunur. Benzer şekilde HLA-DQ ve HLA-DR genleri de α ve β alt birimleri tarafından ifade edilir. Sınıf II bölgesi ayrıca DM, DO, TAP ve LMP gibi antijen sunumuna katılan genleri de içerir. Sınıf III bölgesi ise sınıf I ve II bölgeleri arasında yer almakta olup kompleman bileşenleri, lenfotoksin α ve β, tümör nekroz faktörü (TNF), ısı şok proteinleri (HSP), NFKB, NOTCH4 ve 21-hidroksilaz (CYP21) gibi hem immün hem de immün dışı proteinleri kodlayan genleri içerir (38). Sınıf I ve sınıf II MHC molekülleri, antijen sunumunda kritik rol oynayan karakteristik yapısal özelliklere sahiptir. Her iki molekül tipi de iki polipeptit zincirinden oluşur ve bir peptit bağlayıcı oluk, immün globülin (Ig) benzeri bölgeler, transmembran ve sitoplazmik bölgeler içerir (40). Sınıf I moleküller, 44–47 kDa ağırlığında polimorfik bir α zinciri ve 12 kDa ağırlığında non-polimorfik bir β2-mikroglobulin zincirinden oluşur. Peptit bağlayıcı oluk α1 ve α2 segmentleri tarafından oluşturulmakta, α3 bölgesi ve β2-mikroglobulin ise CD8 koreseptörü ile etkileşim bölgesini meydana getirmektedir (40). Peptit bağlayıcı oluk kapalı uçlara sahiptir ve 8–11 amino asit uzunluğunda peptitler bağlanabilir (38). Sınıf I MHC molekülleri tüm çekirdekli hücrelerde ve trombositlerde eksprese edilir, eritrositlerde ise ekspresyon minimaldir. CD8+ sitotoksik T hücrelerinin enfekte veya tümörleşmiş hücreleri tanıması bu moleküller aracılığıyla gerçekleşir (37). Sınıf I ekspresyonu IFN-α, IFN-β, IFN-γ ve GM-CSF gibi sitokinlerle artırılabilir (38). Sınıf II moleküller, 32–34 kDa ağırlığında bir α zinciri ve 29–32 kDa ağırlığında bir β zincirinden oluşur. Peptit bağlayıcı oluk α1 ve β1 bölgeleri tarafından oluşturulur. Sınıf II moleküllerde peptit bağlayıcı oluğun uçları açık olduğundan, daha uzun (10–30 amino asit) peptitler bağlanabilir (37). CD4 koreseptörü ile bağlanmayı sağlayan alan, α2 ve β2 segmentleri tarafından oluşturulmaktadır (37). Sınıf II MHC molekülleri başlıca dendritik hücreler, makrofajlar, B lenfositler ve timik epitel hücrelerinde eksprese edilir. Bu yapıların görevi, CD4+ T hücrelerini aktive ederek yardımcı işlevleri yürütmektir. MHC moleküllerinin polimorfik amino asit kalıntıları peptit bağlayıcı oluğun içinde veya yakınında yer alır ve bu sayede farklı antijenlerin bağlanmasına olanak tanır. Ig-benzeri alanlar, T hücresi koreseptörlerinin (CD4 veya CD8) bağlanmasına aracılık eder. Sınıf I MHC molekülleri CD8 ile, sınıf II MHC molekülleri CD4 ile etkileşir (40). Her bir MHC molekülü, aynı anda yalnızca bir peptit bağlayabilir ancak farklı zamanlarda birçok farklı peptitle etkileşime girebilir. Buna karşılık, her T hücre reseptörü (TCR), sadece belirli bir peptit-MHC kompleksini tanıyabilir (37). Peptitlerin MHC moleküllerine bağlanması hem peptitte hem de MHC oluğunda yer alan amino asit kalıntıları aracılığıyla gerçekleşen non-kovalent etkileşimlere dayanır. Genellikle, MHC-I moleküllerinin peptit bağlayıcı oluğunun zemininde hidrofobik cepler bulunur ve peptitlerin belirli yan zincirleri (örneğin valin, lözin, metiyonin) bu ceplere bağlanır. Bağlanmada rol oynayan bu amino asit kalıntılarına“çapa kalıntıları”adı verilir. Her peptit genellikle bir veya iki çapa kalıntısına sahiptir; geri kalan kısımlar ise spesifik T hücreleri tarafından tanınır ve bu nedenle daha değişkendir. Sınıf I MHC moleküllerinin peptit bağlayıcı oluğunun uçları kapalıdır ve 8–11 amino asitlik peptitleri barındırabilirken, sınıf II MHC moleküllerinde uçlar açıktır ve daha uzun peptitler (10–30 amino asit) bağlanabilir (40). Sınıf II MHC moleküllerinde, α-heliks yapılar da peptitle ek yük etkileşimleri veya hidrojen bağları oluşturabilir. MHC molekülleri antijenlerini hücre içinde kompleks oluşumu sırasında alırlar. Bu antijenler hem kendinden hem de patojen kökenli olabilir (40). MHC-peptit bağlanması genel olarak doyurulabilir bir etkileşimdir ve ayrışma oranı oldukça düşüktür. Bu düşük ayrışma, komplekslerin T hücreleri tarafından yeterince uzun süre tanınmasına olanak sağlar (37). Araştırmalar, bir peptitin MHC üzerindeki stabilitesinin T hücresi yanıtı ile ilişkili olduğunu, daha uzun yarı ömrüne sahip peptitlerin daha güçlü bağışıklık yanıtı oluşturduğunu göstermiştir (17–19). Buna karşın, düşük stabiliteli ancak yine de immünojenik olabilen bazı antijenler de vardır. Peptit-MHC komplekslerinin az sayıda olması bile antijen-spesifik T hücrelerini aktive etmek için yeterli olabilir (41–44). Ökaryot hücrelerde antijen işleme ve sunum mekanizmaları genel özellikler taşımakla birlikte, peptitin kaynağına göre iki ana yol izlenir: MHC sınıf I ve MHC sınıf II sunum yolları. MHC sınıf I sunumu endojen (hücre içi sentezlenen) antijenleri işler. Bu peptitler, sitoplazmada proteazomlar aracılığıyla parçalanır ve endoplazmik retikulumda (ER) MHC-I moleküllerine yüklenir. Proteazomal degradasyonun ardından peptitler TAP taşıyıcılarıyla ER'ye alınır, burada peptit yükleme kompleksi (PLC) bileşenleri (tapasin, calretikulin, ERp57 gibi) aracılığıyla MHC-I moleküllerine yüklenir (45,46). Uygun olmayan peptitler ERAAP aminopeptidazı tarafından işlenerek uygun boyutlara getirilir. Peptit-MHC-I kompleksleri daha sonra hücre yüzeyine taşınır (51). MHC sınıf II sunumu eksojen (hücre dışı alınan) antijenleri işler. Antijenler, antijen sunan hücreler (APC'ler) tarafından endositoz, fagositoz veya makro pinositoz yoluyla hücre içine alınır. Alınan antijenler endozomal/ lizozomal bölmelerde proteolitik enzimler tarafından parçalanır (49,50). Bu sırada yeni sentezlenen MHC-II molekülleri, ER'de invariant chain (Ii) ile kompleks oluşturur, Golgi'den geçerek endozomal bölmelere taşınır. Ii zinciri burada proteolitik olarak yıkılarak CLIP peptitine dönüşür. HLA-DM molekülü CLIP'i uzaklaştırır ve antijenik peptitin MHC-II'ye bağlanmasını sağlar; HLA-DO ise bu süreci düzenler (52). Peptit-MHC-II kompleksleri daha sonra hücre yüzeyine çıkarılır (53). Dendritik hücreler, eksojen antijenleri MHC-I moleküllerinde sunarak CD8+ T hücrelerini aktive edebilirler. Bu, fagositozla alınan antijenlerin sitozole kaçışı ve burada proteazomal degradasyonu veya endozomal işlenmesi yoluyla gerçekleşir, buna da çapraz sunum adı verilir (46-48). Özetle, MHC-I molekülleri hücre içi kaynaklı proteinleri; MHC-II molekülleri ise hücre dışı kaynaklı proteinleri CD4+ T hücrelerine sunar. Bu sistem, bağışıklık sisteminin kendinden olan ve yabancı antijenleri ayırt edebilmesini sağlar. T lenfositleri, adaptif bağışıklık sisteminin temel bileşenleri olup, enfeksiyonlara ve anormal hücrelere karşı hücresel bağışıklık yanıtını yönetirler. T hücresi gelişimi, kemik iliğinden türeyen timik yerleşim öncüllerinin (TSP'ler) timusa göç etmesiyle başlar. Timusta bu hücreler ardışık gelişim evrelerinden geçer: çift negatif (CD4⁻CD8⁻, DN), çift pozitif (CD4⁺CD8⁺, DP) ve ardından tek pozitif (CD4⁺CD8⁻ veya CD4⁻CD8⁺, SP) aşamaları (54–56). DN aşaması, CD44 ve CD25 ekspresyonuna göre DN1, DN2, DN3 ve DN4 alt evrelere ayrılır (57). Notch sinyallemesi ile erken T hücre öncülleri (ETP'ler) T hücresi soyuna yönlendirilir (58). DN2b ve DN3a evrelerinde TCRγ, TCRδ ve TCRβ genlerinin yeniden düzenlenmesi gerçekleşir ve bu aşamada αβ ve γδ T hücre soyları arasında bir ayrım oluşur (59). Fonksiyonel bir pre-TCR kompleksi (TCRβ + pTα + CD3 proteinleri) oluşumu, DN3'ten DN4 aşamasına ve ardından çift pozitif (DP) timositlere geçişi tetikler. Pozitif seleksiyon sürecinde DP timositler, MHC-peptit komplekslerine orta düzeyde afinite göstererek olgun CD4⁺ veya CD8⁺ hücrelere farklılaşırlar. CD4⁺ hücreler MHC-II'yi, CD8⁺ hücreler MHC-I'i tanır (60). Negatif seleksiyon sürecinde ise, yüksek afinite ile kendinden antijenlere bağlanan timositler ya elimine edilir ya da düzenleyici T hücrelerine (Treg) farklılaşır (61). Erken T hücre öncülleri (ETP'ler) teorik olarak B hücresi, NK hücresi ve myeloid hücre soylarına da farklılaşabilecek potansiyele sahiptir (63). Ancak Notch1 sinyal yolağı, T hücre soyuna özgü gen ekspresyonunu (ör. TCF-1, GATA-3, Bcl11b) uyararak bu yönelimi sağlar (64–66). GATA-3 ve Bcl11b transkripsiyon faktörleri, alternatif hücresel farklılaşmayı baskılar (67,68). Fonksiyonel bir TCRβ zincirinin başarılı şekilde üretilmesi DN3 hücrelerinin pre-TCR kompleksi oluşturmasını sağlar. Pre-TCR sinyallemesi, Notch sinyalleriyle birlikte hücrelerin hayatta kalmasını, proliferasyonunu ve DP timositlere geçişini destekler (69–73). Bu süreç aynı zamanda siklin-bağımlı kinaz inhibitörlerinin yıkımı gibi hücre döngüsü düzenlemelerini içerir (74). Pre-TCR harici bazı mekanizmalar da DN'den DP'ye geçişi destekler. Örneğin, Zfp335 adlı çinko parmak proteini, Bcl6/Rorc ekspresyonunu düzenleyerek veya cGAS/STING yolaklarını baskılayarak timosit hayatta kalışını artırır (75). Pozitif seleksiyonu geçen DP timositler, MHC sınıf I veya sınıf II'ye bağlanan TCR sinyallerine göre CD8⁺ veya CD4⁺ hücrelere farklılaşır (76). İlk aşamada CD8 ekspresyonu azalır, hücreler CD4⁺CD8^lo bir form alır. Güçlü ve sürekli TCR sinyalleri CD4⁺ farklılaşmasını teşvik ederken, zayıf ve geçici sinyaller IL-7 yolakları üzerinden CD8⁺ farklılaşmasını destekler (77,78). Thpok transkripsiyon faktörü CD4 soyuna yönelimi, Runx3 ise CD8 soyuna yönelimi sağlar (79–82). Ayrıca, GATA-3 Thpok ekspresyonunu artırırken IL-7–STAT5 sinyal yolağı Runx3'ü uyararak CD8 farklılaşmasını destekler (83). Timusta gelişimlerini tamamlayan T lenfositleri, antijenle karşılaşana dek G₀ fazında durgun halde bulunan naif hücreler olarak dolaşırlar. Bu durağanlık hali, FOXP1 ve KLF2 gibi transkripsiyon faktörleri tarafından korunur (84). Naif T hücreleri hem lenfoid hem de non-lenfoid dokularda bulunabilir. İnsan vücudunda yaklaşık 2×10¹¹ naif T hücresi ve yaklaşık 10¹⁰ farklı özgül TCR ekspresyonu olduğu tahmin edilmektedir (85). T hücresi aktivasyonu, antijen sunan hücrelerin (APC'ler) patojen veya tümör kaynaklı antijenleri MHC molekülleri üzerinde sunmasıyla başlar. CD4⁺ T hücreleri MHC sınıf II aracılığıyla, CD8⁺ sitotoksik T hücreleri ise MHC sınıf I aracılığıyla aktive edilir. TCR kompleksi, αβ zincirleri ile CD3 sinyal kompleksinden oluşur. TCR-peptit-MHC etkileşimi sonrası, CD4 veya CD8 koreseptörleri Src ailesi kinazı Lck'i TCR'ye yönlendirir. Lck, CD3 ITAM bölgelerini fosforile eder ve ardından Zap70 kinazını aktive eder. Zap70, LAT adaptör proteinini fosforile ederek sinyal yolaklarını başlatır. LAT veya Zap70 mutasyonları ağır kombine immün yetmezlik (SCID) ile ilişkilidir; Lck mutasyonları ise T hücresi eksikliğine yol açabilir (86–88). Tam aktivasyon için yalnızca TCR sinyali yeterli değildir; ikinci bir kostimülatuvar sinyal gereklidir. Bu sinyal, çoğunlukla T hücreleri üzerindeki CD28 molekülünün, APC'lerdeki B7-1 (CD80) veya B7-2 (CD86) ile etkileşimiyle sağlanır. CD28 sinyali, T hücresi hayatta kalışı, proliferasyonu ve sitokin üretimini artırır (89). ICOS, 4-1BB, OX-40 gibi diğer kostimülatuvar moleküller de aktivasyona katkı sağlar. Ayrıca, integrinler de APC'lere yapışmayı güçlendirir ve TCR sinyalizasyonunu stabilize eder (90,91). T hücresi aktivasyonu, NF-κB, NFAT ve AP-1 gibi transkripsiyon faktörlerinin aktive olmasına yol açar. Bu faktörler IL-2 üretimini artırır ve IL-2 reseptör alt birimi CD25'in ekspresyonunu yükseltir. IL-2 sinyali, T hücrelerinin hızlı proliferasyonunu ve efektör hücrelere dönüşmesini tetikler (92,93). Yeni çalışmalar, klasik sitotoksik Tc1 hücreleri dışında, farklı sitokin profilleri sergileyen ve CD4⁺ T hücre alt gruplarına benzer transkripsiyon faktörleri ifade eden çeşitli CD8⁺ efektör T hücresi alt grupları olduğunu ortaya koymuştur. Bu hücreler yalnızca hücre öldürme işleviyle sınırlı kalmayıp, bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesi ve doku homeostazının korunmasında da görev almaktadırlar. Klasik Tc1 hücreleri, perforin, granzyme B, IFN-γ ve TNF-α üretir ve bu sayede enfekte veya tümör hücrelerini yok ederler. Tc1 hücrelerinin farklılaşması, IL-12 sinyali ile yönlendirilir; bu süreçte STAT4, T-bet ve EOMES gibi transkripsiyon faktörleri rol oynar (95). Sitotoksisite klasik olarak perforin-granzyme ve Fas-FasL yollarıyla açıklansa da ferroptoz ve piroptoz gibi alternatif hücre ölüm mekanizmalarının da katkıda bulunabileceği gösterilmiştir (96). Tc1 hücreleri, akciğer kanseri, meme kanseri ve kronik lenfositik lösemi gibi birçok tümör tipinde tümör infiltre eden lenfositlerin (TIL) baskın alt grubunu oluşturur ve yüksek Tc1 varlığı genellikle iyi klinik sonuçlarla ilişkilidir (97–99). Tümörler, Tc1 hücrelerinin yoğunluğuna ve IFN-γ üretimine göre“sıcak”veya“soğuk”olarak sınıflandırılır; sıcak tümörler immünoterapilere daha iyi yanıt verir (100). Viral enfeksiyonlarda da Tc1 hücreleri kritik rol oynar. Enfeksiyonun temizlenmesinden sonra bu hücreler hafıza T hücrelerine dönüşür ve immünolojik korumayı sürdürürler (101–103). Hafıza Tc1 hücreleri, yeniden antijenle karşılaştıklarında hızlı IFN-γ üretirler ve tümör mikro çevresindeki düzenleyici T hücrelerin (Treg) baskılayıcı etkilerine karşı daha dirençlidirler (104–106). Ancak antijenin sürekli varlığı, Tc1 hücrelerinde fonksiyonel tükenmişliğe yol açar. Bu durumda sitotoksik molekül üretimi azalır. TOX transkripsiyon faktörü, bu tükenmişlik fenotipinin ana düzenleyicisi olarak tanımlanmıştır (107,108). Tükenmiş Tc1 hücreleri PD-1, LAG-3, 2B4 ve CD39 gibi inhibitör reseptörleri aşırı derecede ifade eder ve bu da kötü klinik sonuçlarla ilişkilidir (109,110). BATF ve IRF4 transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonu, TOX düzeylerini azaltarak CD8⁺ T hücrelerinin antitümör aktivitesini artırabilir (111). Ayrıca progenitör tükenmiş Tc1 hücreleri (PD-1intCXCR5⁺TCF-1⁺) tedaviye daha iyi yanıt verirken, terminal tükenmiş Tc1 hücreleri (PD-1hiTim3⁺TOX⁺) düşük fonksiyonel kapasiteye sahiptir (112,113). Sonuç olarak, tükenmiş Tc1 hücrelerini yeniden aktive etmeye yönelik stratejiler, kanser ve kronik enfeksiyonlara karşı yeni immünoterapilerin geliştirilmesinde umut verici bir yaklaşım sunmaktadır. MHC Tetramer Teknolojisi, belirli bir peptite özgü T hücrelerini tespit etmek ve miktarını belirlemek için peptit-MHC komplekslerini kullanan bir immünolojik boyama yöntemidir. MHC tetramer teknolojisinin geliştirilmesi, immünoloji alanında büyük bir atılım sağlamış ve antijen-spesifik T hücrelerinin doğrudan gözlemlenmesi ve ölçülmesine imkân tanımıştır. Önceden kullanılan yöntemler, T hücrelerinin proliferatif kapasitelerine bağlı olduğundan, antijen-spesifik T hücrelerinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlayamıyordu. 1996 yılında Altman ve arkadaşları, monomerik pMHC komplekslerinin TCR'den hızla ayrılması nedeniyle etkin boyamanın mümkün olmadığını gözlemlemişlerdir. Bu sorunu aşmak için pMHC moleküllerini multimerize ederek aviditeyi artırmayı önerdiler. Biyotinlenmiş MHC sınıf I ağır zincirleri, floresanla işaretli streptavidin ile 4:1 oranında birleştirilerek tetramer yapısı oluşturuldu. Bu tetramerik pMHC kompleksleri, bir T hücresi üzerindeki birden fazla TCR'yi aynı anda bağlayarak daha kararlı bir etkileşim sağladı. Altman ve arkadaşları, bu yöntemi kullanarak HIV ve influenza virüslerine spesifik CD8⁺ T hücrelerini hem klonlanmış hem de doğal örneklerde başarıyla boyadı. Ayrıca, tetramer boyamasının T hücrelerinin sitotoksik aktivitesi ile yüksek korelasyon gösterdiğini ortaya koyarak yöntemin fonksiyonel geçerliliğini de doğruladılar (114). Bu teknoloji sadece hücrelerin sayımını değil, aynı zamanda yüzey belirteçlerine (örneğin CD45RO, CD62L) göre bellek ve efektör T hücresi alt gruplarının fenotipik analizini de mümkün kılmıştır. Geleneksel MHC tetramerleri, C-terminalinden biyotinlenmiş pMHC monomerlerinin tetramerik streptavidin molekülleri ile birleştirilmesiyle oluşturulmaktadır. Ancak zamanla, duyarlılığı artırmak için farklı multimer geometri ve valansları geliştirilmiştir: pMHC dimerleri, pentamerler ve dextramerler. pMHC dimerleri, bir IgG iskeletine pMHC monomerlerinin füzyonu ile oluşturulmuş ve TCR bağlanması için daha fazla esneklik sağlamıştır. (115,116) Pentamerler ve dextramerler ise daha fazla pMHC kompleksi içererek aviditeyi artırır ve düşük afiniteli T hücrelerinin de tespitine imkân tanır (117). Geleneksel tetramer teknolojisinin önemli bir sınırlaması, boş MHC moleküllerinin yapısal stabilitesinin düşük olmasıdır. Her farklı antijenik peptit için ayrı katlama işlemi gerektirmesi, yüksek verimli analizleri sınırlamıştır. Bu sorunu aşmak için koşullu peptit değişim sistemleri geliştirilmiştir. UV-ile tetiklenen değişim: UV'ye duyarlı bir peptit, sentez sırasında MHC oluğuna yerleştirilir; UV ışığı altında yerinden çıkar ve istenilen peptit yüklenir. (118) Sıcaklıkla değişim: Sıcaklığa duyarlı peptitler belirli sıcaklıklarda yer değiştirir. (10) Disülfid-köprülü stabilize boş MHC-I molekülleri: Burada disülfid bağları ile oluğun şekli sabitlenir, peptit olmadan da stabilite sağlanır. (11,119) Multimerizasyonun bir diğer sorunu, T hücrelerinde kısmi aktivasyon veya tükenmişlik yaratabilmesidir. Bunu aşmak için geri dönüşümlü MHC multimerleri geliştirilmiştir. Streptamerler: Strep-tag/Strep-Tactin sistemini kullanır ve serbest biyotin ile ayrışarak fonksiyonel T hücre izolasyonu sağlar (120). NTAmers: Ni²⁺-NTA ve His-tag sistemlerini kullanır; imidazol ile çözülerek hassas kinetik analiz yapılmasına olanak verir (121). Bu geri dönüşümlü sistemler, fonksiyonlarını koruyan T hücrelerinin izole edilmesine imkân sağlar ve konvansiyonel tetramerlere göre terapötik uygulamalarda daha etkilidir (122). Florofor-kalite problemleri de tetramer etkinliğini etkileyebilmektedir. Streptavidin-florofor oranlarındaki değişiklikler boyama yoğunluğunu etkiler; bu yüzden boyamadan sonra anti-florofor antikorlarının kullanılması veya proteaz inhibitörleriyle TCR internalizasyonunun azaltılması önerilmiştir (123–126). CD8 koreseptörü, TCR-pMHC bağlanmasını stabilize eder. Ancak bazı anti-CD8 antikorlarının tetramer boyamasını artırabileceği ya da engelleyebileceği gösterilmiştir (124). Antijen-spesifik T hücrelerinin frekansı periferik kanda genellikle çok düşük olduğundan, bu hücrelerin tespiti zordur. MHC multimer teknolojisinin geliştirilmesi, bu düşük frekanstaki hücrelerin rutin olarak tespit edilmesini ve analiz edilmesini mümkün kılmıştır. Daha da hassasiyet artırmak için, MHC multimer boyamasının manyetik zenginleştirme yöntemleriyle birleştirilmesi geliştirilmiş ve bu sayede duyarlılık 100 kat artmıştır (127,128). Konvansiyonel multimer boyamaları, her bir antijen-MHC kompleksi için tek bir florofor kullanır; bu durum aynı örnekte çoklu spesifiteyi sınırlamaktadır. Bu sorunu aşmak için, farklı florofor kombinasyonları veya kuantum nokta konjugatlı tetramerler kullanılarak 25 farklı T hücresi popülasyonunun aynı anda tespit edilmesi sağlanmıştır (129). Ancak konvansiyonel akım sitometri spektral örtüşme nedeniyle sınırlıdır. Bu sınırlamayı aşmak için cytometry by time-of-flight (CyTOF) teknolojisi geliştirilmiştir. CyTOF, floroforlar yerine izotop bazlı ağır metaller kullanarak sinyal örtüşmesini ortadan kaldırır ve çok daha yüksek boyutlu analiz imkânı sunar. Bu yöntemle 109 farklı MHC tetramerinin ve 23 fenotipik belirtecin aynı örnekten analiz edilmesi mümkün olmuştur (130–132). Bu teknoloji, tümör spesifik T hücrelerinin tanımlanmasında ve epitop keşfinde önemli bir araçtır (133). DNA barkodlu MHC multimer teknolojisi ise her MHC multimerine özgü bir oligonükleotid barkod ekleyerek, çok geniş epitop kütüphanelerinin taranmasına imkân sağlar. Barkodlar daha sonra yeni nesil dizileme (NGS) ile analiz edilir (12). Bu yaklaşım, düşük afiniteli T hücrelerinin bile tespit edilmesine yardımcı olur. Tetramer teknolojisinin terapötik uygulamaları: MHC tetramerleri, spesifik T hücrelerinin izole edilerek adaptif hücre transferlerinde kullanılması için uygundur. Örneğin, CMV-spesifik CD8⁺ T hücreleri, nakil sonrası hastalarda kullanılmıştır (134). Geri dönüşümlü tetramer sistemleri, T hücre fonksiyonunun korunmasını sağlayarak tedavi edici kullanımlar için avantaj sağlamıştır (120). Ayrıca, radyoaktif izotoplar veya sitotoksik ajanlarla konjuge edilmiş tetramerler kullanılarak belirli T hücre popülasyonlarının in vivo modülasyonu ya da eliminasyonu sağlanabilmiştir (135,136). Son olarak, yapay antijen sunan hücreler kullanılarak, pMHC molekülleri standardize bir platformda immobilize edilerek, antijen-spesifik T hücrelerinin aktivasyonu ve ekspansiyonu mümkün hale gelmiştir (137,138). Bu çalışma, Ekim 2020- Ekim 2022 tarihleri arasında Dr. Mohammad Rashidian'ın laboratuvarında (Kanser İmmünolojisi ve Virolojisi Bölümü, Dana-Farber Kanser Enstitüsü, Boston, Massachusetts, ABD) gerçekleştirilmiştir. MHC-I ağır zincirleri (H-2Kb, dsH-2Kb) ve β2m proteinlerinin üretimi için klonlama, DNA dizileme, bakteri transformasyonu, protein ekspresyonu, yeniden katlama ve saflaştırma adımları uygulanmıştır. Kodon optimizasyonu yapılmış çift sarmallı DNA'lar (Synbio Technologies) Gibson montajı yöntemiyle lineerleştirilmiş pET28 (H-2Kb, dsH-2Kb) ve pET3a (β2m) plazmitlerine klonlandı (139). Dizilimi doğrulanan plazmitler, ısı şok yöntemiyle E. coli BL21(DE3) veya BL21(DE3)pLysS hücrelerine transforme edildi. Plazmitlerin lineerleştirilmesi uygun restriksiyon enzimleri ile sağlandı. Agaroz jel elektroforezi ile doğrulama yapılarak DNA saflaştırıldı (140). Gibson montaj reaksiyonları buz üzerinde hazırlanıp 50 °C'de 1 saat inkübe edildi. Transformasyon sonrası bakteri kolonileri seçilerek ön kültürler oluşturuldu. Ön kültürlerden inoküle edilen bakteriler, Terrific Broth (TB) ortamında 37 °C'de 250 rpm'de büyütüldü. OD600 değeri ~0.6'ya ulaştığında 0.6 mM IPTG ile indüksiyon yapıldı ve 4 saat sonra hücreler 6000g'de santrifüjle toplandı (118). H-2Kb, dsH-2Kb ve β2m proteinleri, bakterilerde inklüzyon cisimcikleri (çözünmeyen protein agregatları) olarak üretildiği için öncelikle inklüzyon cisimciği saflaştırması yapıldı (141). Hücre peletleri lizis tamponu içinde çözülüp sonikasyona tabi tutuldu. Süpernatant atılarak pelet tekrar yıkandı. Elde edilen inklüzyon cisimcikleri 8 M üre çözeltisinde çözülerek SDS-PAGE analizi ile protein varlığı ve saflığı doğrulandı, ardından -20 °C'de saklandı (142). β2m yeniden katlaması için diyaliz yöntemi kullanıldı. Diyaliz sonrası β2m proteinleri FPLC ile saflaştırıldı. H-2Kb yeniden katlaması için β2m ile yeniden katlama tamponu içinde, yavaş enjeksiyon yöntemiyle yeniden katlama yapıldı. Sonrasında konsantrasyon ve FPLC saflaştırması gerçekleştirildi (142). Kodon optimizasyonu yapılmış penta mutant sortaz A dizisi, pET29 vektörüne klonlandı (139). Dizilimi doğrulanan plazmitler E. coli BL21(DE3) hücrelerine transforme edildi. IPTG indüksiyon sonrası protein, Ni-NTA kolonları kullanılarak IMAC yöntemiyle saflaştırıldı ve FPLC ile ileri saflaştırma yapıldı (23). LPETGGG dizisine sahip β2m üretildi. Önce Gly3 molekülü ile LPET motif kesildi ve çoklu glisin kalıntısı açığa çıkarıldı (reaksiyon 1). Sonra azid içerikli LPETG substratı eklenerek β2m'nin N-terminaline azid etiketi eklendi (reaksiyon 2). İşlemler SDS-PAGE ve LC-MS ile doğrulandı. BirA geni, pET21a plazmitine klonlandı ve E. coli BL21(DE3) hücrelerine transforme edildi (139). IPTG indüksiyonu sonrası ekspresyon sağlandı. Hücreler lizis edildikten sonra BirA proteini IMAC ve FPLC yöntemleri ile saflaştırıldı (23). Yeniden katlanmış MHC ağır zincirinin C-terminaline BirA enzimi aracılığıyla biyotin eklendi. Biyotinilasyon verimliliği streptavidin gel-shift analizi ile kontrol edildi ve reaksiyon FPLC ile saflaştırıldı. SIINFEKL-H-2Kb spesifik antikor kullanılarak ELISA kaplama yapıldı. Örnekler üç kopya halinde test edildi. HRP konjugatlı anti-β2m antikoru ile tespit yapıldı ve absorbans 450 nm'de ölçüldü. Tetramerik streptavidin, her biri dört biyotin bağlama bölgesine sahip bir proteindir ve streptavidin-biyotin etkileşimi doğadaki en güçlü non-kovalent bağlardan biridir (143). Streptavidin sentezi için klonlama, DNA dizileme, transformasyon, protein ekspresyonu, yeniden katlama ve sortaz ile floresan işaretleme adımları uygulanmıştır. Sortaz tanıma motifi (LPETG) içeren kodon-optimize streptavidin dizisi, pET28 plazmidine Gibson montajı ile klonlanmıştır (139). Dizisi doğrulanan plazmitler, E. coli BL21(DE3)pLysS hücrelerine ısı şok yöntemiyle aktarılmıştır. Transformasyon sonrası bakteriler MTP ortamında antibiyotikler ve glukoz varlığında kültüre edilmiştir (144). OD600 değeri 1.8-2.2'ye ulaştığında 0.4 mM IPTG ile indüksiyon yapılmış, ekspresyondan 3 saat sonra bakteriler 6000g'de santrifüjle toplanmıştır (144). Streptavidin inklüzyon cisimciği olarak üretilmiştir. Hücre peletleri sonikasyonla lizis edildikten sonra inklüzyon cisimcikleri 6 M guanidin hidroklorür içinde çözülmüş ve saflaştırılmıştır (144). Çözünür inklüzyon cisimcikleri hızlı dilüsyon yöntemi ile PBS'ye aktarılmış ve tetramerik yapıya katlanmaları sağlanmıştır. Amonyum sülfat ile fraksiyonlama yapılarak saf olmayan kısımlar uzaklaştırılmış ve saf tetramerik streptavidin elde edilmiştir (145). Elde edilen tetramerik streptavidinler, sortaz enzimi yardımıyla Gly₃-Alexa647 ile işaretlenmiştir. İşlem sonrası ürünler SDS-PAGE ve LC-MS ile doğrulanmış, >%85 verim sağlanmıştır. Azid ile etiketlenmiş β2m ile alkin modifiye edilmiş peptitler (propargil glisin taşıyan) arasında bakır-katalizli azid-alkin sikloaddisyonu (CuAAC) gerçekleştirilmiştir. Tepkime oda sıcaklığında yapılmış ve SDS-PAGE ve LC-MS ile doğrulanmıştır. %90'dan yüksek verim elde edilmiştir. Biyotinlenmiş peptit-MHC monomerleri, Alexa647 ile işaretli tetramerik streptavidin ile 8:1 oranında inkübe edilerek peptit-MHC tetramerleri oluşturulmuştur. Ürünler SDS-PAGE ve FPLC ile doğrulanarak saflaştırılmıştır. Tüm deneyler, Dana-Farber Kanser Enstitüsü Hayvan Etik Komitesi'nin (protokol no: 20-006) onayı ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmalarda C57BL/6 ve OT-I transgenik fareler kullanılmıştır. Dalak ve lenf nodlarından elde edilen hücre süspansiyonları, ACK lizis tamponu ile işlemden geçirilmiş, PBS + %2 BSA ile yıkanmıştır. Hücreler, anti-CD8α antikoru ve tetramerlerle buz üzerinde boyanmış, ardından akım sitometri analizi yapılmıştır. SIINFEKL peptiti ve varyantlarının yapıları Chimera yazılımı ile oluşturulmuştur (146). MHC-I molekülü 4HS3 PDB dosyasından alınmış ve AutoDock Vina ile docking çalışmaları yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar, referans yapı (PDB ID: 1VAC) ile karşılaştırılarak doğrulanmıştır (119,147). Streptavidin'in immünojenisitesinin önüne geçebilmek ve pMHC moleküllerinin multimerizasyonu için in vitro/in vivo uyumlu yapılar üretilmiştir. VHH05-hCH3, VHH05-hCH3-WAIL2 ve VHH05-hCH3-4-1BBL dizileri pLenti-puro vektörüne klonlanmış ve NEB 5-alpha hücrelerine aktarılmıştır (139). Lentiviral partiküller, HEK293T hücrelerine PEI kullanılarak transfekte edilmiştir. Viral partiküller 48-96 saatler arasında toplanmış ve ultra-santrifüjlenmiştir. Üretilen lentiviral partiküller yeni HEK293T hücrelerine aktarılmış, seçilim için puromisin kullanılmıştır. Ekspresyon sonrası proteinler IMAC ve FPLC ile saflaştırılmıştır. 6E etiketli β2m'nin VHH05-hCH3 dimere bağlanması, SDS-PAGE ve FPLC analizleriyle doğrulanmıştır. BALB/c, C57BL/6 ve OT-I transgenik farelerden elde edilen CD8⁺ T hücreleri CFSE ile boyanmış ve anti-CD3 kaplı plaklara ekilmiştir. Test edilen moleküller ile inkübasyon sonrası hücre proliferasyonu akım sitometri ile analiz edilmiştir. Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism v10.1.1 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. EC₅₀ hesaplamaları için doğrusal olmayan regresyon analizi yapılmış, grup karşılaştırmalarında tek yönlü ANOVA ve Tukey çoklu karşılaştırma testi uygulanmıştır. Çok değişkenli analizlerde iki yönlü ANOVA kullanılmıştır. p ≤ 0.05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Bu çalışmada, yaklaşımı kurmak ve ispat amacıyla, iyi karakterize edilmiş bir model olan tavuk ovalbumin kaynaklı SIINFEKL peptiti kullanılmıştır. SIINFEKL peptiti, C57BL/6 farelerindeki MHC I alellerinden biri olan H-2Kb üzerinde sunulmakta ve OT-I transgenik farelerin CD8⁺ sitotoksik T hücrelerinin TCR'ları tarafından tanınmaktadır. Sortaz enzimi, LPXTG amino asit dizilimini tanıyan ve bu motifin T ve G amino asitleri arasını kesen bir bakteriyel transpeptidazdır (148,149). Bu özellik, protein dizilerine“LPETG”gibi bir tanıma motifinin eklenmesiyle, hedef proteinlere spesifik prob eklenmesine imkân sağlamaktadır (23,150). β2m protein dizisi, N-terminalinde“LPETGGG”sortaz tanıma motifini içerecek şekilde modifiye edilmiştir. Bakteriyel inklüzyon cisimciği olarak üretilen ve Tris tamponunda yeniden katlanan β2m, G₃ ve sortaz enzimi eklenerek 4 °C'de inkübe edilmiştir. SDS-PAGE ve LC-MS analizleri ile LPET motifinin kesildiği doğrulanmıştır (Şekil 4.3, 4.6). Sonrasında, azid içeren LPETG substratı ve sortaz ile ikinci bir reaksiyon gerçekleştirilerek N-terminali azid işaretli β2m elde edilmiştir. Elde edilen ürün yaklaşık %80 verimle doğrulanmış ve saflaştırılmıştır. Azid-alkin klik reaksiyonu kullanılarak peptit-β2m konjugasyonu gerçekleştirilmiştir (151). SIINFEKL peptitinin C-terminaline G2, G3, G4 glisin bağlayıcıları veya PEG3, PEG5 bağlayıcıları eklenmiştir. Reaksiyon sonrası LC-MS ile >%90 verim elde edilmiş ve ürünler saflaştırılmıştır. Docking simülasyonları ile farklı bağlayıcılar içeren SIINFEKL peptitlerinin dsH-2Kb molekülüne bağlanma özellikleri incelenmiştir (152–154). RMSD değeri 1.006 bulunmuş ve bağlayıcıların MHC I molekülü ile bağlanma afinitelerini olumsuz etkilemediği gösterilmiştir (Şekil 4.4, 4.5; Tablo 4.1). Avi-tag içeren dsH-2Kb ağır zincirleri üretilmiş, daha sonra SIINFEKL-clicked-β2m molekülleriyle yeniden katlama gerçekleştirilmiştir. İlave serbest SIINFEKL peptiti eklenmeden yeniden katlama yapılmış ve ürünler SDS-PAGE ve LC-MS analizleriyle doğrulanmıştır (Şekil 4.3, 4.6). ELISA testi kullanılarak, klik yapılmış farklı SIINFEKL-ara parça (spacer) moleküllerinin antikor (25-D1.16 klonu) ile bağlanma afiniteleri değerlendirilmiştir (155,156). Negatif kontrollerle kıyaslandığında (p

Benzer Tezler

  1. Tez No

    702549

    Meme kanserinde foliküler yardımcı T lenfositlerin fonksiyonel ve moleküler analizi

    Functional and molecular analysis of follicular helper T lymphocytes in breast cancer patients

    İZEL YILMAZ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Allerji ve İmmünolojiBursa Uludağ Üniversitesi

    İmmünoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HALUK BARBAROS ORAL

    PROF. DR. GÜNEŞ ESENDAĞLI

  2. Tez No

    401220

    SA-4-1BBL as a platform to develop adjuvant systems for prophylactic and therapeutic vaccines

    Başlık çevirisi yok

    GÜNEŞ DİNÇ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    MikrobiyolojiUniversity of Louisville

    DR. HAVAL SHIRWAN

  3. Tez No

    246720

    Enhanced immunomodulatory applications of nucleic acid encapsulating liposomes

    Nükleik asit içeren lipozomların gelişmiş immünmodülatör uygulamaları

    ERDEM ERİKÇİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    Biyoteknolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. İHSAN GÜRSEL

  4. Tez No

    790068

    Kanser tanı ve tedavisinde kullanılmak üzere anti-PD-L1-scFv antikor geliştirilmesi

    Development of anti-PD-L1-scFv antibody for use in cancer diagnosis and treatment

    CANSU BABAHAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    OnkolojiAnkara Üniversitesi

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HAKAN AKBULUT

  5. Tez No

    556936

    Therapeutic potential of an immunosuppressive oligodeoxynucleotide encapsulated within liposomes on bleomycin-induced mouse model of lung inflammation and fibrosis

    Lipozoma yüklenmiş immünbaskılayıcı bir oligodeoksinükleotidin bleomisin ile farede oluşturulmuş akciğer enflamasyonu ve fibrozu üzerindeki tedavi edici potansiyeli

    GİZEM KILIÇ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Allerji ve İmmünolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İHSAN GÜRSEL

Geri Dön