miniSOG-p28 füzyon proteininin in siliko dizaynı ve Komagataella phaffii ile rekombinant üretimi
In silico design of miniSOG-p28 fusion protein and recombinant production with Komagataella phaffii
- Tez No: 959325
- Danışmanlar: DOÇ. DR. YAĞMUR ÜNVER, DOÇ. DR. DERYANUR KILIÇ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 82
Özet
Amaç: Bu çalışmada bir fotoduyarlaştırıcı olan miniSOG proteini ile kanser hücrelerine nüfuz yeteneğine sahip p28 peptitinin birlikte (füzyon) üretimi için uygun bir bağlayıcının in siliko analizlerle belirlenmesi, rrekomibnant proteinin Komagataella phaffii tarafından metanol bağımsız üretimi ve saflaştırılması amaçlandı. Yöntem: İlk olarak, in siliko yöntemlerle miniSOG ve p28 arasına yerleştirilecek en uygun bağlayıcı sekansı belirlendi. Füzyon proteinin ifadesi için tasarlanan DNA sekansı, pPICZαA vektörüne yerleştirilmiş hade temin edildi ve rekombinant DNA doğrulandıktan sonra K. phaffi hücrelerine transfer edildi. Transformantların doğrulanması için koloni PCR yapıldı. PTVA (posttransformational vector amplification) seçilimi sonrası antibiyotiğe drençli kolonlerden ikisi BMMY (tamponlanmış metanol kompleks ortam) besiyerinde 72 saat boyunca inkübasyona bırakıldı. Kültür ortamlarına 24 saatte bir %0,5 metanol ilave edildi. Ekstraselüler protein üretimi SDS-PAGE ile doğrulandı. Metanol bağımsız protein üretimi öncesinde YPD (Yeast Peptone Dextrose) broth ortamına inoküle edilen hücreler 120 saat boyunca inkübasyona bırakıldı. Kültür ortamına her 12 saatte bir 400 ve 800 nM SNP (sodyum nitroprussid) ilave edildi. 24 saatte bir kültür ortamından alınan örneklerin OD600 değerleri ölçüldü ve spot testi yapıldı. Ardından, BMSY (tamponlanmış sorbitol kompleks ortam) besiyerinde 72 saat boyunca inkübasyona bırakılan kültür ortamlarına 24 saatte bir farklı konsantrasyonlarda (200, 400, 600 ve 800 nM) SNP ilave edildi. Süre sonunda alınan örnekler ile western blot analizi yapıldı. Son olarak, 120 saat boyunca inkübasyona bırakılan kültür ortamlarına yaklaşık 12 saate bir 400 nM SNP ilave edildi ve 24 saatte bir alınan örnekler ile western blot analizi yapıldı. Optimum koşullar altında üretilen rekombinant protein afinite tekniğiyle saflaştırıldı ve proteinin saflığı SDS-PAGE ile belirlendi. Bulgular: Yapılan in siliko analizler sonucunda miniSOG ile p28 peptiti arasına yerleştirilecek en uygun bağlayıcının GSAGSAAGSGEF olduğu belirlendi. pPICZαA miniSOG-L-p28, K. phaffii hücrelerinin genomuna başarılı bir şekilde entegre edildi. SDS-PAGE sonucunda metanol varlığında üretilen rekombinant proteine ait bant gözlendi. Metanol bağımsız miniSOG GSAGSAAGSGEF-p28 üretimi sonrası yapılan western blot analizi sonucuna göre, optimum SNP miktarının 400 nM olduğu belirlendi. 96 saatlik inkübasyon süresinde yaklaşık 12 saatte bir 400 nM SNP ilave edilen kültür ortamında maksimum protein üretiminin gerçekleştiği görüldü. Rekombinant füzyon protein başarılı bir şekilde saflaştırıldı. Sonuç: Bu tez çalışmasında yapılan in siliko analizler sonucu miniSOG-p28 füzyon proteini için en uygun bağlayıcı belirlenmiş ve füzyon protein K. phaffii hücreleri tarafından başarılı bir şekilde üretilmiştir. Üretilen protein saf olarak elde edilmiştir. MiniSOG-GSAGSAAGSGEF-p28 füzyon proteini, fotodinamik tedavide kullanım potansiyeline sahiptir.
Özet (Çeviri)
Purpose: In this study, we aimed to determine, a suitable linker for the co-production (fusion) of miniSOG protein, a photosensitizer, and p28 peptide, a peptide capable of penetrating cancer cells, by in silico analysis, and the methanol-independent production and purification of the recombinant protein by Komagataella phaffii. Method: First, the most suitable linker sequence to be placed between miniSOG and p28 was determined by in silico methods. The designed DNA sequence for expression of the fusion protein was inserted into the pPICZαA vector and transferred into K. phaffi cells after confirming the recombinant DNA. Colony PCR was performed to confirm transformants. After PTVA (posttransformational vector amplification) selection, two of the antibiotic-resistant colonies were incubated in BMMY (buffered methanol complex medium) for 72 hours. 0.5% methanol was added to the culture medium every 24 hours. Extracellular protein production was confirmed by SDS-PAGE. Prior to methanol-independent protein production, cells were inoculated in YPD (Yeast Peptone Dextrose) broth and incubated for 120 hours. 400 and 800 nM SNP (sodium nitroprusside) were added to the culture medium every 12 hours. OD600 values of samples taken from the culture medium were measured every 24 hours, and spot tests were performed. Subsequently, SNP was added at different concentrations (200, 400, 600, and 800 nM) to the culture medium, which was incubated in BMSY (buffered sorbitol complex medium) for 72 hours, every 24 hours. Western blot analysis was performed on the samples taken at the end of this period. Finally, 400 nM SNP was added to the culture media, which were incubated for 120 hours, approximately every 12 hours, and samples were taken every 24 hours for Western blot analysis. The recombinant protein produced under optimal conditions was purified by affinity technique, and protein purity was determined by SDS-PAGE. Findings: As a result of in silico analyses, GSAGSAAGSGEF was determined to be the most suitable linker to be inserted between miniSOG and the p28 peptide. pPICZαA miniSOG-L-p28 was successfully integrated into the genome of K. phaffii cells. SDS-PAGE revealed a band belonging to the recombinant protein produced in the presence of methanol. Western blot analysis following methanol-independent miniSOG-GSAGSAAGSGEF-p28 production determined the optimum SNP amount to be 400 nM. Maximum protein production was observed in culture medium in which 400 nM SNP was added approximately every 12 hours during the 96-hour incubation period. The recombinant fusion protein was successfully purified. Results: As a result of in silico analyses performed in this thesis, the most suitable linker for miniSOG-p28 fusion protein was determined and the fusion protein was successfully produced by K. phaffii cells. The produced protein was obtained as pure. The miniSOG-GSAGSAAGSGEF-p28 fusion protein has the potential for use in photodynamic therapy.