Geri Dön

Viral kapsid proteinlerinden antimikrobiyal etkili peptit tasarımı ve pıchıa pastorıs ekspresyon sisteminde rekombinant üretimi

Recombinant production of antimicrobial effective viral capsid proteins in pichia pastoris expression system

PDF İndir

  1. Tez No: 983481
  2. Yazar: ESRA AVCI
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZÜLAL KESMEN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Gıda Mühendisliği, Biyoteknoloji, Microbiology, Food Engineering, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Erciyes Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Bu tez çalışması kapsamında, Inoviridea ailesine ait bakteriyofaj kapsid proteinlerini hedef alan bir antimikrobiyal peptid (AMP) tasarım stratejisi geliştirilmiştir. Bu amaçla ViralZonu veri tabanındaki Inoviridea ailesine ait kapsid proteinleri taranarak 10-50 amino asit uzunluğundaki peptitler (Grup 1) ve 50-100 amino asit uzunluğundaki peptitler (Grup 2) olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. Net pozitif yükü +2 ile +11 ve hidrofobisitesi %30-%60 aralığında olan peptitler, AMP adayı olarak filtrelenmiştir. Grup 1 peptitlerin antibakteriyel aktiviteleri CAMPR3 programıyla tahminlenmiş ve en yüksek skora (1.197) sahip Thermus faj PH75'in kapsid proteini“PH75-orj”üretilmek üzere seçilmiştir. Bu peptidin antimikrobiyal etkinliğini artırmak amacıyla N-terminaline“GKWRKR”motifi eklenerek modifiye“PH75-mdf”peptidi tasarlanmıştır. Grup 2 peptitlerde ise, AntiBP programı kullanılarak antibakteriyel olarak aktif bölgeler belirlenmiştir. Vibrio faj VFJ'e ait kapsid proteinin en yüksek skorlu iki bölgesi (1-25. ve 58-73. aminoasitler arası) birleştirilerek VFJ-mdf modifiye peptidi oluşturulmuştur. Tasarlanan peptit dizilerini kodlayan DNA fragmentleri rekürsif PCR ile amplifiye edildikten sonra pPICZαA ekspresyon vektörüne bağlanarak rekombinant vektörler (pPICZαA-VFJ-mdf, pPICZαA PH75-orj, pPICZαA-PH75-mdf) oluşturulmuştur. Rekombinant vektörler öncelikle E. coli DH5α bakteriyel konakçısında klonlanmış, ardından elektroporasyon yöntemiyle P. pastoris X33 hücrelerinin genomuna entegre edilmiştir. Rekombinant P. pastoris X33 suşları önce BMGY ortamında ön kültüre alınmış, ardından protein ekspresyonu için BMMY ortamına transfer edilmiştir. 96 saatlik metanol (%1) indüksiyonundan sonra, kültür süpernatantına salınan rekombinant peptitler (rVFJ-mdf, rPH75-orj ve rPH75-mdf) %60 amonyum sülfat ile çöktürüldükten sonra sırasıyla Sephadex G-25 ve Sephadex G 10 jel filtrasyon kolonları kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan peptitlerin konsantrasyonları ELISA yöntemi ile sırasıyla 258±1.42 µg/mL (rVFJ-mdf), 184±1.25 vii µg/mL (rPH75-orj) ve 128±1.09 µg/mL (rPH75-mdf) olarak belirlenmiştir. Rekombinant peptidlerin antimikrobiyal aktiviteleri agar difüzyon ve minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) analizleri ile birçok patojen bakteri ve Candida suşlarına karşı test edilmiştir. Rekombinant peptidlerin MİK değerlerinin 4->128 µg/mL arasında değiştiği ve en yüksek inhibisyon aktivitesini Listeria monocytogenes ATCC 7644 ile Yersinia enterocolitica ATCC 27729 suşlarına karşı gösterdikleri tespit edilmiştir. Bununla birlikte rekombinant peptitlerin Staphylococcus aureus ATCC 25923, metisilin dirençli S. aureus ATCC 43300, Candida albicans ATCC 10231 ve ATCC 90028 suşlarına karşı >128 µg/mL seviyesine kadar inhibisyon etkisi göstermediği tespit edilmiştir. Diğer taraftan rPH75-orj peptidinin modifikasyonu ile elde edilen PH75-mdf peptidinin Gram negatif bakterilere karşı inhibisyon aktivitesinde belirgin bir artış ve MİK değerlerinde ise 1xMİK ile 3xMİK arasında değişen seviyelerde düşüş tespit edilmiştir. Bununla birlikte bu modifikasyon hemolitik aktivitede de artışa yol açmış, 16 µg/ml seviyesinde rPH75-orj peptidi için %3 olarak belirlenen hemoliz değeri, PH75-mdf peptidinde %95'e yükselmiştir. Sonuç olarak bu çalışma, faj kapsid proteinlerinin antimikrobiyal peptit geliştirme süreçlerinde yapısal bir şablon olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Elde edilen sonuçlar, bakteriyofaj türevli AMP'lerin hem klinik enfeksiyonlarla mücadelede hem de gıda koruma gibi endüstriyel uygulamalarda potansiyel bir alternatif olabileceğini ortaya koymuştur.

Özet (Çeviri)

In this thesis, an antimicrobial peptide (AMP) design strategy targeting bacteriophage capsid proteins of the Inoviridea family was developed. For this purpose, capsid proteins from the Inoviridae family in the ViralZonu database were screened and categorized into two groups: peptides with lengths of 10-50 amino acids (Group 1) and peptides with lengths of 50-100 amino acids (Group 2). Peptides with a net positive charge of +2 to +11 and hydrophobicity between 30-60% were filtered as potential AMP candidates. The antibacterial activities of Group 1 peptides were predicted using the CAMPR3 program, and the capsid protein“PH75-orj”from Thermus phage PH75, which had the highest score (1.197), was selected for production. To enhance the antimicrobial efficacy of this peptide, the“GKWRKR”motif was added to its N-terminus, resulting in the modified peptide“PH75-mdf.”For Group 2 peptides, antibacterially active regions of peptides were identified using the AntiBP program. The two regions of the capsid protein of Vibrio phage VFJ (between amino acids 1-25 and 58-73), which had the highest scores, were combined to design the modified VFJ-mdf peptide. DNA fragments encoding the designed peptide sequences were amplified by recursive PCR and ligated into the pPICZαA expression vector to generate recombinant vectors (pPICZαA-VFJ-mdf, pPICZαA-PH75-orj, pPICZαA-PH75-mdf). The recombinant vectors were cloned in E. coli DH5α and then integrated into the genome of P. pastoris X33 cells via electroporation. Recombinant P. pastoris X33 strains were precultured in BMGY medium and then transferred to BMMY medium for protein induction. After a 96-hour induction with 1% methanol, the recombinant peptides (rVFJ-mdf, rPH75-orj, and rPH75-mdf) secreted into the culture supernatant were precipitated using 60% ammonium sulfate. The precipitated peptides were then sequentially purified via Sephadex G-25 and G-10 gel-filtration chromatography. The concentrations of the purified peptides were ix determined by ELISA to be 258±1.42 µg/mL (rVFJ-mdf), 184±1.25 µg/mL (rPH75-orj), and 128±1.09 µg/mL (rPH75-mdf). The antimicrobial activities of the recombinant peptides were tested against various pathogenic bacteria and Candida strains using agar diffusion and minimum inhibitory concentration (MIC) assays. The MIC values of the recombinant peptides ranged between 4 and >128 µg/mL. The highest inhibitory activity observed against Listeria monocytogenes ATCC 7644 and Yersinia enterocolitica ATCC 27729. However, the recombinant peptides showed no inhibitory activity (up to >128 µg/mL) against Staphylococcus aureus ATCC 25923, methicillin-resistant S. aureus ATCC 43300, Candida albicans ATCC 10231 and ATCC 90028. On the other hand, the inhibitory activity of modified PH75-mdf peptide, derived from rPH75-orj, significantly increased against Gram-negative bacteria while MIC values decreased from 1xMIC to 3xMIC. However, this modification also led to increase hemolytic activity. The hemolysis rate for rPH75-orj was 3% at 16 µg/mL, it was found to be 95% for PH75-mdf. This study demonstrates that phage capsid proteins can serve as structural templates in the development of antimicrobial peptides. The results suggest that bacteriophage-derived AMPs could serve as a potential alternative for combating clinical infections as well as in industrial applications such as food preservation.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    83737

    Molecular cloning and characterization of the common 1b subtype of HCV from Turkey

    Türkiye'de baskın olarak görünen hepatit C virüsü 1b alt tipinin moleküler klonlanması ve karakterizasyonu

    ASLI ÖZTAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1999

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  2. Tez No

    749780

    Investigation of the interaction and oligomerization of HIV capsid and single domain antibody as a biotechnological drug against HIV

    HİV'e karşı biyoteknolojik ilaç olmak üzere HİV kapsit ve tek bölgeli antikorun etkileşimi ve oligomerizasyonun incelenmesi

    SENİHA GÜNEY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ HÜMEYRA TAŞKENT SEZGİN

  3. Tez No

    846978

    Chilo ıridescent virüs replikasyonunun başlamasında rol oynayan hücresel proteinlerin belirlenmesi

    Determination of cellular proteins playing a role in the start of chilo iridescent virus replication

    KÜBRA ZENGİN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. REMZİYE NALÇACIOĞLU

  4. Tez No

    508830

    Viral vektör aracılıklı gen aktarımı yöntemi ı̇le farelerin kortikal nöronlarının görüntülenmesi

    Imaging of mouse cortical neurons by viral vector mediated gene transferring

    SANAZ RAGHIB

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    NörolojiEskişehir Osmangazi Üniversitesi

    Sinir Bilimleri Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. EMEL ULUPINAR

  5. Tez No

    238986

    Sentetik viral peptidler kullanılarak polielektrolit esaslı biyokonjugatların geliştirilmesi

    Developing bioconjugates which based on polyelectrolytes, using synthetic viral peptides

    ZAFER ÖMER ÖZDEMİR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2008

    BiyokimyaYıldız Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ZEYNEP AKDESTE

Geri Dön