Geri Dön

Cloning of chitinase a gene (chiA) from Serratia marcescens BN10 and its expression in coleoptera-specific Bacillus thuringiensis

Kitinaz a geninin (chiA) Serratia marcescens BN10'dan klonlaması ve coleoptera-spesifik Bacillus thuringiensiste ifade edilmesi

  1. Tez No: 167098
  2. Yazar: SEZER OKAY
  3. Danışmanlar: PROF.DR. GÜLAY ÖZCENGİZ, Y.DOÇ.DR. MELEK ÖZKAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Serratia marcescens, Bacillus thuringiensis, gen klonlanması, chiA geni, kitinaz üretimi vıı, Serratia marcescens, Bacillus thuringiensis, gene cloning, chiA gene, chitinase production
  7. Yıl: 2005
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 208

Özet

oz KITINAZ A GENİNİN {CHJA) SERRATIA MARCESCENS BNIO'DAN KLONLANMASI VE COLEOPTERA-SPESİFİKA4CttZtf,S THURINGIENSIS'TE İFADE EDİLMESİ Okay, Sezer Yüksek Lisans, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Gülay Özcengiz Ortak Tez Yöneticisi: Y. Doç. Dr. Melek Özkan Eylül 2005, 102 sayfa Fungal hücre duvarı ve böcek dış iskeleti temel yapı bileşeni olarak kitin içerdiğinden kitinaz enzimleri hem çeşitli bitki hastalıklarına neden olan fitopatojen funguslara hem de zararlı böceklere karşı biyolojik kontrol ajanı olarak kullanılma potansiyeline sahiptirler. Bunun yanısıra kitinaz enziminin böcek larvalarına karşı ölümcül etki gösteren Bacillus thuringiensis kristal (Cry) proteinlerinin toksik etkisini artırdığı da gösterilmiştir. Bu sinerjinin nedeni, larva bağırsak epitelinin dış zarının kitin içermesidir. Bu çalışmada, kitinaz A enzimini kodlayan gen (chiA) Trabzon ili çevresinden izole edilmiş olan Serratia marcescens BnlO'dan PCR yoluyla çoğaltılmış ve klonlanarak E. colli Bacillus vektörlerine (pNW33N ve pHT315) yerleştirilmiştir. B. vıthuringiensis'te gen ifadesinin sağlanması için B. thuringiensis Mm2'ye ait cryS Aal 1 geninin promoter bölgesi chiA geninin 5' ucuna yerleştirilmiştir. Cry3Aall promotoru altında chiA genini taşıyan vektörler ara konakçılar olarak önce E. coif ye, sonra B. subtilis 168'e aktarılmıştır. chiA'yı taşıyan pHT315PC vektörü daha sonra Kınkanatlılar' a karşı toksik etkiye sahip olan B. thuringiensis hücrelerine aktarılmıştır. Rekombinant B. thuringiensis' İn spesifik kitinaz aktivitesi 5056 Ünite/dakika/mg olarak ölçülmüştür. Bu değer ana suş B. thuringiensis 3023 'ün kitinaz aktivitesinin 6.3 katı, S. marcescens kitinaz aktivitesinin ise yaklaşık üçte biri kadardır. Klonlanan chiA geninin nükleotid dizisi analiz edilmiştir. Dizi GenBankası'na sunulmuş ve DQ 165083 numarasını almıştır. S. marcescens BnlO'a ait chiA geni 60.9 kDa moleküler ağırlığa sahip 563 amino asitlik bir protein kodlamaktadır. Genin ortalama G+C içeriği % 58.75 'dir. Amino asit dizisinin S. marcescens, Burkholderia cepacia ve Enterobacter cinsine ait türlerin bilinen kitinaz dizileriyle karşılaştırılması sonucunda bu kitinazlara %99.3-91.5 oranında benzerlik gösterdiği ve korunmuş diziler içerisinde altı amino asitinin farklı olduğu tesbit edilmiştir. Yerli izolat S. marcescens BnlO tarafından farklı kültür koşullarında kitinaz üretimi incelenmiştir. Kitinaz üretimi için optimum sıcaklık ve pH sırasıyla 30 °C ve 7.5 olarak bulunmuştur. Kolloidal kitinin farklı konsantrasyonlarının ve besiyerine eklenen NAG'nin kitinaz üretimine belirgin bir etkisi saptanmamıştır. Daha sonra sıcaklık, pH, substrat konsantrasyonu ve elementlerin inhibisyonu gibi farklı parametrelerin enzim aktivitesi üzerine etkisi araştırılmıştır. S. marcescens BnlO'a ait kitinaz pH 4.0-9.0 aralığında 45 °C'de en yüksek aktivite vermiştir. Kitinaz aktivitesi 35 ng/mL'ye kadar artan substrat konsantrasyonlarına bağlı olarak artmıştır. Daha sonra, Ca, Co, Cu, EDTA, Fe, Mg, Mn ve Zn 'nin enzim aktivitesi üzerine etkileri araştırılmıştır. 10 mM EDTA mn enzimi %4 oranında inhibe ettiği, 10 mM Co+2 in ise aktiviteyi %20 oranında artırdığı görülmüştür.

Özet (Çeviri)

ABSTRACT CLONING OF CHITINASE A GENE (CHIA) FROM SERRATIA MARCESCENS BN10 AND ITS EXPRESSION IN COLEOPTERA-SPECIFIC BACILLUS THURINGIENSIS Okay, Sezer M. Sc, Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Gülay Özcengiz Co-Supervisor: Assist. Prof. Dr. Melek Özkan September 2005, 102 pages Chitinases have been shown to be potential agents for biological control of the plant diseases caused by various phytopathogenic fungi and insect pests, because fungal cell walls and insect exoskeletons contain chitin as a major structural component. Chitinase has also been found to increase the efficacy and potency of Bacillus thuringiensis crystal (Cry) proteins toxic to larvae of insect pests. The reason of this synergy is the presence of chitin in the structure of the outer membrane of larval midgut. In this study, the gene encoding chitinase A (chiA) from Serratia marcescens BnlO, a local isolate of Trabzon province was amplified by PCR and cloned into the E.coli/Bacillus shuttle vectors, pNW33N and pHT315. For the expression in B. IVthuringiensis, the promoter region of cry3 Aal 1 gene of B. thuringiensis Mm2 was placed at the upstream of chiA. The vectors carrying both chiA and promoter site of cry 3 Aal 1 was first introduced into E. coli and then into Bacillus subtilis 168 which were used as intermediate hosts in this study. pHT315PC carying chiA was then introduced into Coleoptera-specific B. thuringiensis cells (strain 3023) and the specific chitinase activity of the recombinant B. thuringiensis was measured as 5056 U/min/mg which was 6.3 fold higher than that of the parental strain. The specific activity corresponded to about one third of that produced by S. marcescens BnlO. The chiA gene was next sequenced and characterized. The sequence was submitted to GeneBank (Accession No. DQ1 65083). Chitinase A of S. marcescens BnlO was found to be a 563 residue protein with a calculated molecular mass of 60.9 kDa. The mean G+C content of the gene is 58.75%. The deduced amino acid sequence was 99.3-91.5% identical to those of known chitinases from S. marcescens, Burkholderia cepacia and Enterobacter sp. It was found that the chitinase of S. marcescens Bnl 0 has six amino acids difference from the consensus sequence of aligned chitinases. The production of chitinase by the local isolate S. marcescens BnlO in different cultural conditions was also investigated. Optimum temperature and pH for chitinase production was found to be 30 °C and 7.5, respectively. Varying the concentration of colloidal chitin and the inclusion of NAG into the medium had no effect on chitinase production. The effect of different parameters such as temperature, pH, substrate concentration and certain inhibitory elements on enzyme activity were next assayed. The highest activity was obtained at 45 °C and in a pH range of 4.0 to 9.0. Activity of chitinase increased with increasing substrate concentration up to 35 ug/mL. Ca, Co2+, Cu2+, EDTA, Fe2+, Mg2+, Mn2+ and Zn2+ were tested for their effects on the activity of enzyme. The enzyme was inhibited by only 4% in the presence of 10 mM EDTA, whereas 10 mM Co2+ included in the assay mixture increased the activity by 20%.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    847127

    Serratia marcescens GBS19 izolatına ait kitinaz A gen bölgesinin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve tarım zararlısı Myzus persicae üzerine insektisidal akitivitesinin incelenmesi

    Cloning, expression, purification of the chitinase A gene region of serratia marcescens GBS19 isolation and investigation of insecticidal effect on agricultural pest Myzus persicae

    AHMET CAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyomühendislikMuğla Sıtkı Koçman Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖMÜR BAYSAL

  2. Tez No

    244526

    Helicoverpa armıgera'dan izole edilen serratıa marcescens bakterisine ait kitinaz A, B ve C genlerinin klonlanması, karakterizasyonu, ekspresyonu ve enzim aktivitelerinin belirlenmesi

    Characterisation, expression, and purification, of chitinase A, B and C genes isolated from serratia marcescens originating from Helicoverpa armigera and determining their enzyme activity

    MEHTAP YAKUPOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2009

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. REMZİYE NALÇACIOĞLU

  3. Tez No

    846937

    Pieris brassicae'den izole edilen serratia ficariabakterisine ait kitinaz proteinlerinin moleküler karakterizasyonu ve virulans etkisinin belirlenmesi

    Molecular characteri̇zati̇on of chi̇ti̇nase protei̇ns of serratia ficaria bacteri̇a i̇solated from pieris brassicae and determi̇nati̇on of thei̇r vi̇rulence effects

    MERVE ALMULA BAKIRDÖĞEN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyoteknolojiErzurum Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ GÖZDE BÜŞRA EROĞLU

  4. Tez No

    387351

    Farklı yöntemlerle kitosan eldesi ve karakterizasyonu

    Synthesis and characterization of chitosan by different methods

    İLKAY KOÇER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    Kimya MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HÜLYA YAVUZ ERSAN

    YRD. DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR

  5. Tez No

    77061

    Bacillus subtilis'e ait selülaz genlerinin e.coli'de klonlanması

    Cloning of Bacillus subtilis cellulase genes in e.coli

    BAHRİ DEVRİM ÖZCAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1998

    ZiraatÇukurova Üniversitesi

    Zootekni Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NUMAN ÖZCAN

Geri Dön