Geri Dön

Expression of recombinant acid protease (thermopsin) gene from thermoplasma volcanium

Thermoplasma volcanium rekombinant asit proteaz (termopsin) geninin ekspresyonu

  1. Tez No: 172248
  2. Yazar: BİLSEV KOYUNCU
  3. Danışmanlar: PROF.DR. SEMRA KOCABIYIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Ekspresyon, 6XHis, asit proteaz, termopsin, Thermoplasma volcanium, Expression, 6XHis tag, acid proteases, thermopsin, Thermoplasma volcanium
  7. Yıl: 2006
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 129

Özet

ÖZ THERMOPLASMA VOLCANIUM REKOMBİNANT ASİT PROTEAZ (TERMOPSİN) GENİNİN EKSPRESYONU KOYUNCU, Bilsev Yüksek Lisans, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Semra KOCABIYIK Ocak, 2006,113 sayfa Aspatik proteazlar olarakta bilinen asit proteazlar, proteinlerin peptit bağlannın yıkımı reaksiyonlarını katalizleyen hidrolitik enzimlerdir (optimum pH 3-4). Asit proteazlar metabolizmada çok önemli görevlere sahiplerdir. Aynı zamanda endüstrinin farklı alanlarında da kullanılmaktadırlar. Termofilik mikroorganizmalar, özellikle archaea, yüksek ısılarda kararlılıklarını koruyabildikleri için hem temel bilimsel araştırmalarda hem de endüstriyel araştırmlarda ilgi çekici hale gelmiştir. Proteazlann A5 ailesinin bir üyesi olan termopsin, hücre dışı bir asit proteazdır. Bu ısıya dayanıklı enzim; asit proteazlara özgü aspartil gruplarının eksikliği ve diğer asit proteazlarla bir homolojisinin bulunmaması nedeniyle yeni bir asit proteaz grubu olarak düşünülmüştür.Optimum büyüme sıcaklığı 55°C ve pH 2.7 olan termofîlik bir archaea olan Thermoplasma volcanium GSS1 susu bir asit proteaz enzimi üretmektedir. Bu çalışmada teraıopsin geni ekspresyonu; genin 6XHis kuyruğuyla birleşerek T5 transkripsiyon/translasyon sistemi kontrolü altında gerçekleşmiştir. Thermoplasma volcanium asit proteaz geni PCR methodu ile olası thermopsin genini kapsayan TP1/TP2 ve TP1VTP2 primer setleri kullanılarak çoğaltılmıştır. PCR sonucu 3080bp ve 3070bp PCR ürünleri elde edilmiştir. TP1' primeri genin başlangıç kodonunu içermemektedir. PCR ile çoğaltılmış termopsin genini içeren rekombinant pDrive ve pUC18 vektörleri, Şali, Sphl v HindRI restriksiyon enzimleriyle, pQE ekspreyon vektörlerine genin yönlü olarak klonlanması için kullanılmıştır. E. coli M15[pREP4], SG130009[pREP4] ve TG1 suşlan konukçu microorganizmalar olarak kullanılmıştır. Recombinant kolonilerin bulunması için immünolojik tarama temeline dayanan koloni hibridizasyon tekniği; 6XHis kuyruğuna özel Anti-His HRP konjugat ve renkli DAB substratı kullanılarak uygulanmıştır. Çalışma sırasında PCR ile çoğaltılan 3080bp termopsin geni pQE30 ve 31 vektörlerinde eksprese edilememiştir. pQE32 vektörü ekspresyon çalışması için denenecektir. PCR ile çoğaltılan 3070bp termopsin genini içeren recombinant pQE31-l, pQE31-4 ve pQE31-6 vektörlerinde genin ekspresyonu koloni blot hibridizasyon tekniğiyle belirlenmiş ve agaroz gel elektroforezi ile onaylanmıştır.

Özet (Çeviri)

ABSTRACT EXPRESSION OF RECOMBINANT ACID PROTEASE (THERMOPSIN) GENE FROM THERMOPLASMA VOLCANIUM KOYUNCU, Bilsev M.Sc, Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Semra KOCABIYIK January, 2006, 113 pages Acid proteases, commonly known as aspartic proteases are degredative enzymes which catalyze the cleavage reaction of peptide bonds in proteins with a pH optimum in the acidic range (pH 3-4). Acid proteases have crucial roles in metabolism. Moreover, they are used in different fields of industry. Thermophilic microorganisms, especially archaea, gain special interest because of their thermal stability for both fundamental and industrial researches. Thermopsin is an extracellular acid protease and a member of A5 family of proteases. This thermophilic enzyme has no characteristic active aspartyl residue, is insensitive to pepstatin and no apparent sequence homology to other acid proteases and therefore represents a new class of acid proteases. Thermophilic archaeal strain Thermoplasma volcanium GSS1 (optimum temperature 55°C and pH 2.7) in the genome has a putative thermopsin gene encoding 998 amino acid enzyme. IVin this study thermopsin gene from Thermoplasma volcanium was expressed in E. coli as fusion with 6xHis tag under the control of T5 transcription/translation system. Putative thermopsin gene from Thermoplasma volcanium was amplified by PCR method using two primer sets and cloned. A 3080 bp and a 3070bp PCR products were obtained by using TP1/TP2 primer set (thermopsin gene with the start codon) and TP1VTP2 primer set (thermopsin gene missing start codon) respectively. PCR amplified thermopsin genes pDrive and pUC18 vectors in E. coli TG1 were cloned using and then cloned genes were sub-cloned directionally into pQE triple vector set for expression. in these expression vectors, cloned genes are placed downstream of a 6XHis tag to produce an expression fusion. E. coli strains (M15[pREP4], SG13009[pREP4], and TG1) used as hosts. Recombinant colonies screened by colony blot/hybridization method based on immunological detection of the expressed 6XHis tag fusion by Anti-His HRP conjugates which are specific for 6xHis tag, and DAB chromogenic substrate was used for colony blot procedure. PCR amplified thermopsin gene containing 3080bp could not expressed in pQE30 and 31 vectors in TG1 strains. it is thought that pQE32 öpen reading frame can be true for thermopsin gene (3080bp). Three expression constructs, pQE31-l, pQE31-4 and pQE31-6 plasmids containing PCR amplified 3070bp thermopsin gene were confirnıed as true recombinant plasmids according to both colony blot hybridization result and restriction digestion profile the agarose gel.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    668652

    Production of enzymes for food industry via solid state fermentation and optimization of process conditions

    Katı hal fermantasyonu ve proses koşullarının optimizasyonu yoluyla gıda endüstrisi için enzimlerin üretimi

    BAHTIR HYSENI HYSENI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyomühendislikYeditepe Üniversitesi

    Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ İLKEM EMRAH NİKEREL

  2. Tez No

    360841

    Chılo ırıdescent virüs (cıv)'e ait matriks metalloproteinaz genlerinin (136r & 165r) bakülovirüs vektör sisteminde ifadesi ve ürünlerinin aktivite tayini

    Expression of chilo iridescent virus (civ) matrix metalloproteinase genes (136r & 165r) in baculovirus expression vector system and determination of the activities of the products

    AYDIN YEŞİLYURT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. REMZİYE NALÇACIOĞLU

  3. Tez No

    795663

    Caretta caretta kaynaklı defensin benzeri TEWP peptidi ve analoglarının Pichia pastoris ekspresyon sisteminde rekombinant üretimi

    Recombinant production of TEWP defensin-like peptide from Caretta caretta and its analogues in Pichia pastoris expression system

    SAİME GÜLSÜM BATMAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyoteknolojiErciyes Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZÜLAL KESMEN

  4. Tez No

    688848

    Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis

    Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    EVRİM KAPUCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  5. Tez No

    463601

    Effect of signal sequences and promoters in recombinant extracellular protein production by Pichia pastoris

    Sinyal dizinlerin ve promotorların Pichia pastoris ile hücre-dışı rekombinant protein üretimine etkisi

    ASLAN MASSAHI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ D. SON

Geri Dön