Hidroksil radikal süpürülmesine dayalı antioksidan aktivite ölçümünde yeni bir yöntem geliştirilmesi
Development of a novel method for antioxidant activity measurement based on hydroxyl radical scavenging
- Tez No: 178208
- Danışmanlar: PROF.DR. REŞAT APAK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2007
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Analitik Kimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 88
Özet
Oksijen yaşam için gereklidir, ancak vücut üzerinde zararlı etkileri de vardır. Oksijen, insan vücudunda solunum zinciri içersinde süperoksit, singlet oksijen, hidroksil radikali vb. reaktif oksijen türlerini (ROS) oluşturmaktadır. Hidroksil radikali bilinen en reaktif serbest radikaldir ve vücutta serbest radikal hasarının en önemli sorumlusudur. Reaktif oksijen birikimi organizmada mevcut olan veya gıdayla alınan antioksidanlarla dengelenmediği taktirde; oluşan oksidatif stres koşulları altında biyolojik yapıların hasarına neden olabilen radikalik zincir reaksiyonları meydana gelmektedir. Canlı organizmalarda hidroksil radikalinin süpürülmesi için özel bir molekül veya enzim bulunmamaktadır. Hidroksil radikalleri sentetik antioksidanlar veya gıdalarla alınan antioksidanlar tarafından süpürülmektedir. Bu nedenden ötürü, antioksidanların hidroksil radikal süpürme aktivitelerinin ölçümü büyük önem taşımaktadır. Çeşitli antioksidanların hidroksil radikali süpürme yeteneklerinin ve bu maddelerin hidroksil radikali ile reaksiyon hız sabitlerinin bilinmesi gerekmektedir. Bu nedenle bilim dünyasında kabul gören, basit, kullanışlı, hızlı, ucuz ve duyarlı antioksidan aktivite ölçme yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu kapsamda bu tez çalışmasının amaçları; insan sağlığı üzerinde doğrudan etkisi bulunan hidroksil radikallerini süpürme yeteneğine sahip antioksidanların aktivitelerinin yeni bir yöntem ile belirlenmesi ve bulunan ikinci mertebeden hız sabitlerinin referans yönteminkiler ile karşılaştırılarak doğruluğunun ispatlanmasıdır. Bu çalışmada; literatürde CUPRAC yöntemi olarak bilinen toplam antioksidan kapasite yöntemi temel alınmıştır. Spektrofotometrik bir yöntem olan CUPRAC yöntemi modifiye edilerek hidroksil radikal süpürülmesine dayalı antioksidan aktivite ölçülmesinde kullanılabilir duruma getirilmiştir. Kromojenik yükseltgeme aracı olarak kullanılan bakır(II)-neokuproin (Cu(II)-Nc) reaktifi varlığında prob madde ile hidroksil radikallerinin reaksiyonu sonucunda oluşan hidroksillenmiş ürünlerin, Cu(II)-Nc kompleksini 450 nm'de maksimum ışık soğurması gösteren Cu(I)-Nc kompleksine indirgemesi ve kendilerinin uygun kinonlara yükseltgenmesinden yararlanılarak çeşitli hidroksil radikal süpürücülerin antioksidan aktiviteleri bulunmuştur. Hidroksil radikalleri Fe(II) + EDTA + H2O2'den oluşan Fenton reaksiyonuyla üretilmiş ve radikal oluşumu yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile salisilat probu kullanılarak gösterilmiştir. Bu şekilde oluşan hidroksil radikallerinin süpürücü varlığında veya yokluğunda prob madde (p-amino benzoat veya 2,4-dimetoksi benzoat veya 3,5-dimetoksi benzoat) ile reaksiyonu sonucunda oluşan hidroksi benzoik asitler etil asetat ile ekstrakte edilerek reaksiyon ortamından organik faza çekilmiştir. Süpürücü varlığında ve yokluğunda organik fazda toplanan hidroksi benzoik asitlerin miktar tayini, bu faza CuCl2, Nc ve amonyum asetat tamponu (pH 7 tamponu) ilavesi sonunda 30 dakika beklemekle, reaktif körüne karşı 450 nm absorbansının ölçümü yoluyla yapılmıştır. Reaksiyon ortamında süpürücü bileşiğin bulunması kullanılan prob madde ile süpürücünün hidroksil radikalleri için yarışmasına neden olmaktadır. Süpürücü bileşiğin hidroksil radikalleriyle vermiş olduğu reaksiyonun hızı yüksekse oluşan hidroksi benzoik asit ürün miktarı ve dolayısıyla Cu(I)-Nc kompleks oluşumu azalmaktadır. CUPRAC absorbansındaki bu azalıştan faydalanarak yarışmalı kinetik yöntemine göre süpürücü bileşiklerin hidroksil radikalleriyle ikinci mertebeden hız sabitleri hesaplanmıştır. Bu kapsamda hidroksil radikal süpürücülerin Modifiye CUPRAC yöntemi ile bulunan ikinci dereceden reaksiyon hız sabitleri, antioksidan aktivite tayini için kullanılan TBARS (Tiyobarbitürik Asitle Reaksiyon Veren Maddeler) referans yönteminin bulgularıyla karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma sonucunda hem TBARS hem de CUPRAC yöntemiyle elde edilen verilere göre sodyum metabisülfit (k3,5-DMB = 5.62x109 M-1s-1), DMSO (k3,5-DMB = 4.24x109 M-1s-1), sodyum tiyosülfat (k3,5-DMB = 3.92x109 M-1s-1), sodyum format (k3,5-DMB = 1.89x109 M-1s-1) gibi süpürücülerin askorbik asit (k3,5-DMB = 7.4x108 M-1s-1), mannitol (k3,5-DMB = 6x108 M-1s-1) ve glikozdan (k3,5-DMB = 5.1x108 M-1s-1) daha hızlı süpürücüler olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca geliştirilen Modifiye CUPRAC yöntemi salisilat probu kullanılarak HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) yöntemiyle doğrulanmıştır. HPLC yöntemiyle salisilat probu için 2,3-dihidroksibenzoik asit, 2,4-dihidroksibenzoik asit ve 2,5- dihidroksibenzoik asit olmak üzere üç adet hidroksillenme ürünü bulunmuştur.
Özet (Çeviri)
Oxygen is essential for life, but it may also have harmful effects on the organism. Oxygen may form various reactive oxygen species (ROS) in the respiratory chain, namely superoxide, singlet oxygen, hydroxyl radical, etc. Hydroxyl radical is the most reactive free radical known, and is the most important agent responsiple for free radical damage to the organism. If the ROS accumulation is not balanced by existing or foodinjested antioxidants in the organism, radicalic chain reactions may ocur under oxidative stres conditions that may cause tissue damage. There is no special molecule or enzyme responsible for hydroxyl radical scavenging in the organism. Hydroxyl radicals are scavenged by either synthetic or food-injested antioxidants. Therefore measurement of the radical scavenging activity of these antioxidants bears great importance. It is required to know the hydroxyl radical scavenging ability and rate constants of hydroxyl radical quenching of various antioxidants. For this purpose, simple, readily available, rapid, inexpensive and sensitive techniques of antioxidant activity assay are required that may find wide approval in the scientific community. In this regard, the aims of this thesis study are; measurement of antioxidant activity of antioxidant capable of scavenging hydroxyl radicals having a direct influence on human health with the use of a novel technique, and comperison of the second-order rate constants of radical quenching with those found by the reference assay for method validation. This study is based on the total antioxidant capacity determination known as the ?CUPRAC method? in the literature. The original spectrophotometric CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity) method was modified and adapted to antioxidant activity measurement based on hydroxyl radical scavenging. The hydroxyl radical scavenging antioxidant activity of the tested compounds was found by measuring their inhibitive effect on the hydroxylation of the probe by hydroxyl radicals. The hydroxylated reaction products were quantified by their reduction ability of Cu(II)-Nc complex reagent to Cu(I)-Nc chelate showing maximum absorbance at 450 nm, the hydroxylated probes themselves being oxidized to the corresponding quinones. The hydroxyl radicals were generated by a Fenton reaction consisting of a (Fe(II) + EDTA + H2O2) mixture, and the radical production was demonstrated using high performance liquid chromatography (HPLC) with salicylate probe. The hydroxyl radicals thus produced reacted with the probe materials (i.e., p-aminobenzoate, 2,4- dimethoxybenzoate, and 3,5- dimethoxybenzoate) in the presence and absence of scavengers, and the hydroxybenzoic acids resulting from the reaction were isolated by solvent extraction with ethylacetate. The quantitative determination of hydroxybenzoic acids extracted in the organic phase was made by adding cupric chloride, neocuproine, and pH 7 buffer ( ammonium acetate) to the ethylacetate phase, and measuring the 450 nm-absorbance after 30 min against a reagent blank not containing the hydroxylated products. If the rate constant of scavenger for hydroxyl radicals was high, then the amount of formed hydroxybenzoic acids was low, and therefore the Cu(I)-Nc chelate yield was low. By making use of this decrease in CUPRAC absorbance, the second order rate constants of scavenger compounds for hydroxyl radicals were calculated with the aid of competition kinetics measurement technique. In this regard, the second order rate constants found with the modified CUPRAC method were compared with those found with the reference method of antioxidant activity assay, TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances). Sodium metabisulfite (k3,5-DMB = 5.62x109 M-1s-1), DMSO (k3,5-DMB = 4.24x109 M-1s-1), sodium thiosulfate (k3,5-DMB = 3.92x109 M-1s-1), sodium formate (k3,5-DMB = 1.89x109 M-1s-1) were found faster than ascorbic acid (k3,5-DMB = 7.4x108 M-1s-1), mannitol (k3,5-DMB = 6x108 M-1s-1), glucose (k3,5-DMB = 5.1x108 M-1s-1). In addition, the developed CUPRAC method was validated with HPLC using salicylate probe. Salicylate prob has three hydroxylation products which are 2,3- ; 2,4- and 2,5-dihydroxy benzoic acid were verified by HPLC method.
Benzer Tezler
- Reaktif oksijen türleri süpürücü antioksidan aktivitenin ölçümünde modifiye CUPRAC yöntemlerinin geliştirilmesi
Development of modified CUPRAC methods for reactive oxygen species scavenging antioxidant activity measurement
MUSTAFA ÖZYÜREK
- Biyolojik örneklerde reaktif oksijen türleri süpürme etkinliği ölçümü için spektrofotometrik yöntemler geliştirilmesi
Development of spectrophotometric methods for measurement of reactive oxygen species scavenging activity in biological samples
BURCU BEKDEŞER
Doktora
Türkçe
2012
Kimyaİstanbul ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUSTAFA ÖZYÜREK
PROF. DR. REŞAT APAK
- Biyolojik örneklerde peroksil radikali süpürme etkinliği ölçümü için spektroflorometrik yöntem geliştirilmesi
Development of a spectrofluorometric method for measurement of peroxyl radical scavenging activity in biological samples
GÜLŞAH KIBRISLIOĞLU
- Endemik centaurea Tuzgoluensis Aytaç & H. Duman ve Centaurea lycaonica Boiss. & Heldr.'nın fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri üzerine tuz stresinin etkileri
Effects of salt stress on physiological and biochemical characteristics of endemic Centaurea Tuzgoluensis aytaç & H. Duman and Centaurea lycaonica Boiss. & Heldr.
EVREN YILDIZTUGAY
- Zygophyllum fabago L.'nun lipid peroksidasyon, antioksidan enzimler ve prolin içeriği üzerine tuz stresinin etkileri
The effect of salt stress on lipid peroxidation, antioxidative enzymes and proline content of Zygophyllum fabago L.
ZEYNEP ÜLKÜ