Cytochrome C purification with immobilized metal affinity chromatography (IMAC)
İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile sitokram C saflaştırılması
- Tez No: 197028
- Danışmanlar: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Kimya, Biochemistry, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: MAK, manyetik küreler, PHEMA, sitokrom c adsorpsiyonu, MSFB, IMAC, magnetic beads, PHEMA, cytochrome c adsorption, MSFB
- Yıl: 2005
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 100
Özet
Zmmobilize metal iyon afinite kromatografisi ( MAK) terapötik proteinlerin,peptidlerin, nükleik asitlerin, hormonların ve enzimlerin saflaştırılması için yaygınolarak kullanılan bir analitik ayırma yöntemidir. Birçok geçiş metal iyonu elektroncazengin bileşiklerle kararlı kompleksler oluştururlar ve O, N ve S içeren moleküllerleiyon dipol etkileşimleriyle koordinasyon bağı kurarlar. Birinci sıra geçiş metaliyonları (Zn2+, Ni2+, Cu2+ ve Fe3+) iminodiasetik asit, nitriloasetik asit vetris(karboksimetil)etilen-diamin gibi bileşikler üzerinden kompleksleştirilerek MAKsorbenti elde edilebilir. MAK'de şelatlanmış metal iyonuna gore afiniteleri temelinegöre ayırma sağlanır. Bu çalışmada, MAK ile sitokrom c saflaştırılması için metalşelat oluşturucu ligand olarak poli(etilen imin) (PEI) içeren manyetik poli(hidroksietilmetakrilat) (m-PHEMA) küreler hazırlanmıştır. Sitokrom c mitokondriyal solunumzincirinin heme içeren bir elektron taşıyıcısıdır. PEI'in primer imin grupları metaliyonları ile şelat oluşturucu özelliğe sahiptir. Ortalama 100-140 m boy aralığındakim-PHEMA mikroküreler magnetit partikülleri (Fe3O4) varlığında süspansiyonpolimerizasyonu ile üretilmiştir. Manyetik kürelerin spesifik yüzey alanı ve ortalamagözenek çapı sırası ile 50 m2/g ve 819 nm'dir. PHEMA yapısındaki ester gruplarıNaH varlığında PEI ile reaksiyona sokularak imin gruplarına dönüştürülmüştür. PEIyüklemesi 102 mg PEI/g polimer olarak bulunmuştur. Daha sonra, küreler üzerineCu2+ iyonları şelatlanmıştır (0-793 mol Cu2+/g polimer). Sulu çözeltilerden MAKsorbente sitokrom c adsorpsiyonu farklı koşullarda incelenmiştir. m-PHEMA/PEIkürelere sitokrom c adsorpsiyonu 4.61 mg/g'dır. Cu2+ takılması adsorpsiyonumol/g Cu2+ taşıyan polimerlerin maksimumönemli derecede artırmıştır. 320sitokrom c adsorpsiyon kapasitesi pH 11.0 karbonat tamponunda 30.1 mg/g olarakbelirlenmiştir. Sıcaklık ve iyonik şiddetin artmasıyla adsorpsiyon kapasitesiazalmıştır. Kesikli deneylerde belirlenen optimum koşullarda MSFB sistemindeadsorpsiyon deneyleri yürütülmüştür. Adsorpsiyon kapasitesi akış hızının 0.5ml/dk'dan 4 ml/dk'ya çıkarılması ile 26.87 mg/g'dan 5.36 mg/g değerine düşmüştür.iAdsorpsiyon kapasitesinde önemli bir azalma olmaksızın sitokrom c molekülleri onkez tersinir olarak adsorbe-desorbe edilebilmektedir. Elde edilen manyetik şelatoluşturucu küreler uzun süreli depolama kapasitesine sahiptir.
Özet (Çeviri)
Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) has become a widespreadanalytical and preparative separation method for therapeutic proteins, peptides,nucleic acids, hormones, and enzymes. Many transition metals can form stablecomplexes with electron rich compounds and may coordinate moleculescontaining O, N, and S by ion dipole interactions. Metal ion ligands are first-rowtransition metal ions (Zn2+, Ni2+, Cu2+, and Fe3+) incorporated by iminodiaceticacid, nitrilotriacetic acid, and tris(carboxymethyl)ethylene-diamine. In this study,we propose preparation of magnetic poly(hydroxyethyl methacrylate) (m-PHEMA)beads containing poly(ethylene imine) PEI as a metal-chelating ligand for use inthe IMAC for cytochrome c purification. Cytochrome c is a heme containingelectron carrier of the mitochondrial respiratory chain. The primary imine groups ofPEI have a chelating property with transition metal ions. Magnetic beads (m-PHEMA) with an average diameter of 100-140 m were produced by suspensionpolymerization in the presence of magnetit particles (i.e. Fe3O4). Specific surfacearea and average pore size of the magnetic beads was found to be 50 m2/g and819 nm, respectively. Ester groups in the PHEMA structure were converted toimine groups by reacting with PEI in the presence of NaH. PEI loading was foundto be 102 mg PEI/g polymer. Then, Cu2+ ions were chelated on these beads (0-793 mol Cu2+/g polymer). Then, cytochrome c adsorption on the metal chelatingbeads from aqueous solutions containing different amounts of cytochrome c, atdifferent buffers and pH levels were performed. The cytochrome c adsorption onthe m-PHEMA/PEI beads was 4.61 mg/g. Cu2+ complexion increased thecytochrome c adsorption significantly. The maximum cytochrome c adsorptioncapacity of the Cu2+-chelated beads (carrying 320 mol Cu2+ per g of polymer)was found to be 30.1 mg/g at pH 11.0 in carbonate buffer. Cytochrome cadsorption decreased with increasing temperature and ionic strength. Cytochromec adsorption experiments were performed in a magnetically stabilized fluidized bed(MSFB) system at optimum conditions determined from the batch experiments.iiiThe adsorption capacity decreased significantly from 26.78 mg/g to 5.36 mg/gpolymer with the increase of the flow-rate from 0.5 ml/min to 4.0 ml/min.Cytochrome c molecules could be reversibly adsorbed and desorbed ten timeswith the magnetic adsorbents without noticeable loss in their cytochrome cadsorption capacity. The resulting magnetic chelator beads posses excellent longterm storage stability.
Benzer Tezler
- Sitokrom c saflaştırılması için süpermakrogözenekli immobilize metal afinite kromotografi adsorbentler
Supermacroporous immobilized metal affinity chromatography (IMAC) adsorbents for cytochrome c purification
DUYGU ÇİMEN
- Yeni akrilat kökenli afinite kürelerin tasarlanması: Protein adsorpsiyonu ve saflaştırılmasında kullanılması
Design of the new acrylate based affinty beads and the use of adsorption and purification of protein
AYŞEGÜL ÜLKÜ METİN
Doktora
Türkçe
2008
BiyoteknolojiKırıkkale ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GÜLAY BAYRAMOĞLU
PROF. DR. M. YAKUP ARICA
- Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşmalı kütle spektrometrisinde yapılacak proteolitik parçalanma temelli proteomik çalışmaları için, enzim immobilize edilmiş sol-jel yüzeylerin geliştirilmesi
Development of proteolytic enzyme immobilized sol-gel target surfaces for digestion based proteomic studies in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
ÖZLEM DEMİREL
- Cytochrome C purification with surface imprinted bacterial cellulose nanofibers
Yüzey baskılanmış bakteriyel selüloz nanofiberler ile Sitokrom C saflaştırılması
EMEL TAMAHKAR IRMAK
Doktora
İngilizce
2014
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ADİL DENİZLİ
PROF. DR. TÜLİN KUTSAL
- Partial purification and characterization of NADH-cytochrame b5 reductase from mullet liver microsomes
NADH-sitokrom b5 redüktaz enziminin kefal karaciğer mikroorganizmalarından kısmi olarak saflaştırılması ve karakterizasyonu
ZAHİDE KABAKLAR
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMEL ARINÇ