Characterization of thermophilic gene expression enzymes
Isı seven gen anlatım enzimlerinin tanımlanması
- Tez No: 270391
- Danışmanlar: PROF. DR. NEŞE BİLGİN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2010
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 232
Özet
Bacillaceae ailesi içerisinde Geobacillus genus'una ait ve yeni tür olarak tanımlanmış yedi Geobacillus türünün DNA polimeraz I genleri klonlanmış, DNA dizileri belirlenmiş ve Escherichia coli içinde sentezlenmiştir. DNA polimeraz I geninin 99.3 kDa molekül ağırlığına sahip 878 amino asit uzunluğunda bir proteini kodladığı saptanmıştır. Benzerlik karşılaştırmaları sonucunda DNA polimeraz I genlerinin DNA polimerazların A ailesine ait olduğu ve 3'-5' ekzonükleaz aktivitesine sahip olmadığı anlaşılmıştır. Polimeraz genlerinin protein kodlayan dizileri Gen Bankasına kaydedilmiştir. (His)6 içeren füzyon DNA polimeraz I proteini Nikel-bağlama kromatografisi ile saflaştırılmış ve saf proteinler TEV proteaz enzimi ile kesilmesi sonrasında elde edilmiştir. Geobacillus anatolicus (Gana DNApolI) ve Geobacillus kaue (Gkaue DNApolI) DNA polimeraz enzimleri in vitro ortamda karakterize edilmiş, enzimlerin optimum sıcaklığı, pH değeri ve optimum tek ve iki değerlikli iyon derişimleri belirlenmiştir. Geobacillus DNA polimeraz fragmenti (GF DNApolI) benzerlik modelleme yöntemi ve Bacillus fragmenti örnek kalıp olarak kullanılarak elde edilmiş, klonlanmış ve saflaştırılmıştır. GF DNApolI enziminin sadakati, in vitro koşullarda M13mp2 DNA'sının lacZ ? genini içeren tek iplikli boşluğunu DNA sentezi ile tamamlarken yaptığı hataları ölçebilen iki farklı deney sistemi ile, 37°C, 50°C ve 72°C sıcaklıklarında incelenmiştir. Enzimin baz değişimi hataları sıcaklık 37°C'tan 72°C'a çıkartıldığında üç kat artış göstermiştir. Faj mutantlarının DNA dizi analizi yapıldığında, baz değişimlerinin bazılarının sıcaklığa daha duyarlı olduğu gözlemlenmiştir. En çok görülen baz değişimi kalıp G bazının karşısına dGMP yanlış nükleotidinin eklenmesidir. GF DNApolI enziminin tek bir nükleotidi ekleme hızı ?pre-steady state? koşullarda 22°C, 37°C ve 50°C sıcaklıklarında ölçülmüştür. Doğru ve yanlış nükleotidin ekleme hızı (kpol) sıcaklık 22°C'tan 50°C'a yükseltildiğinde doğru nükleotid için 7 kat ve yanlış nükleotid için 4 kat artış göstermiştir. Her iki nükleotid için, enzimin bağlanma sabiti (Kd) çok az değişim gösterirken, enzimin verimliliği (kpol/Kd) söz konusu sıcaklık değişiminde 5 kat artmıştır.
Özet (Çeviri)
The DNA polymerase I genes of seven newly identified Geobacillus species within the family Bacillaceae, were cloned, sequenced and overexpressed in Escherichia coli. The polA gene of these species encodes DNA polymerase I of 878 amino acid residue protein with a predicted molecular weight of 99.3 kDa. Similarity analyses suggested that DNA polymerases belong to family A polymerases and lack 3'-5' exonuclease activity. The complete coding sequences of the genes were submitted into the GenBank. The recombinant (His)6-tagged DNA polymerases were purified by Ni2+-affinity chromatography and the homogeneous proteins were obtained after TEV protease digestion. DNA polymerases from Geobacillus anatolicus (Gana DNApolI) and Geobacillus kaue strain NB (Gkaue DNApolI) were further characterized in vitro and optimum conditions with respect to temperature, pH, monovalent and divalent ions were determined. Geobacillus DNA polymerase I fragment (GF DNApolI) was cloned and purified after homology modeling using Bacillus DNA polymerase I fragment (BF) as the model protein structure. The accuracy of GF DNApolI was measured by two M13 based fidelity assays which score errors produced during in vitro DNA synthesis of the lacZ ? complementation gene in M13mp2 DNA at 37°C, 50°C and 72°C. Base substitution errors increase three-fold when temperature is raised from 37°C to 72°C. DNA sequencing of the phage mutants showed that some of the base substitutions are more temperature sensitive than others. The most common base substitution error is the misincorporation of dGMP opposite to template G. Single nucleotide incorporations for both correct and for incorrect nucleotides were also studied under single-turnover conditions at 22°C, 37°C and 50°C. For both correct and incorrect dNTP insertions, the rate of polymerization, kpol, increased (seven- and four-fold, respectively) when temperature is raised from 22°C to 50°C, whereas only a slight change in Kd was observed. As a result, kinetic efficiency of the enzyme (kpol/Kd) shows five-fold increase over this temperature range.
Benzer Tezler
- Discovery of novel enzymes using proteomic approaches
Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi
MERVE ÖZTUĞ KILINÇ
Doktora
İngilizce
2021
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ
- Anoxybacillus flavithermus WK1 AfCDA geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve biyokimyasal karakteriasyonu
Cloning, expression, purification and enzymatic characterization of AfCDA gene from Anoxybacillus flavitheermus WK1
AYŞENUR EMİNOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2012
BiyokimyaRecep Tayyip Erdoğan ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CEMAL SANDALLI
- Termofilik geobacıllus Sp. TF16'dan ksilanazın klonlanması, ekspresyonu, immobilizasyonu, karakterizasyonu ve endüstriyel uygulamalarının incelenmesi
Cloning, expression, immobilisation, characterization of xylanase from Thermophilic geobacillus Sp. TF16 and investigation of industrial applications
ÜMMÜHAN ÇAKMAK
Doktora
Türkçe
2015
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NAGİHAN SAĞLAM ERTUNGA
- Candida diddensiae format dehidrogenaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Recombinant expression and characterization of Candida diddensiae formate dehydrogenase enzyme
EDA ARSLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyokimyaYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EMEL ORDU
- Biyoetanol üretimi için Thermotoga naphthophila'dan β-ksilanazın moleküler klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Molecular cloning, expression and characterization of β-xylanase from Thermotoga Naphthophila for bioethanol production of bioethanol
ÖZGENUR DİNÇER
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
BiyoteknolojiBartın ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET KARADAĞ
PROF. DR. KEMAL BÜYÜKGÜZEL