Geri Dön

Characterization of thermophilic gene expression enzymes

Isı seven gen anlatım enzimlerinin tanımlanması

  1. Tez No: 270391
  2. Yazar: MELİKE ÇAĞLAYAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NEŞE BİLGİN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2010
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 232

Özet

Bacillaceae ailesi içerisinde Geobacillus genus'una ait ve yeni tür olarak tanımlanmış yedi Geobacillus türünün DNA polimeraz I genleri klonlanmış, DNA dizileri belirlenmiş ve Escherichia coli içinde sentezlenmiştir. DNA polimeraz I geninin 99.3 kDa molekül ağırlığına sahip 878 amino asit uzunluğunda bir proteini kodladığı saptanmıştır. Benzerlik karşılaştırmaları sonucunda DNA polimeraz I genlerinin DNA polimerazların A ailesine ait olduğu ve 3'-5' ekzonükleaz aktivitesine sahip olmadığı anlaşılmıştır. Polimeraz genlerinin protein kodlayan dizileri Gen Bankasına kaydedilmiştir. (His)6 içeren füzyon DNA polimeraz I proteini Nikel-bağlama kromatografisi ile saflaştırılmış ve saf proteinler TEV proteaz enzimi ile kesilmesi sonrasında elde edilmiştir. Geobacillus anatolicus (Gana DNApolI) ve Geobacillus kaue (Gkaue DNApolI) DNA polimeraz enzimleri in vitro ortamda karakterize edilmiş, enzimlerin optimum sıcaklığı, pH değeri ve optimum tek ve iki değerlikli iyon derişimleri belirlenmiştir. Geobacillus DNA polimeraz fragmenti (GF DNApolI) benzerlik modelleme yöntemi ve Bacillus fragmenti örnek kalıp olarak kullanılarak elde edilmiş, klonlanmış ve saflaştırılmıştır. GF DNApolI enziminin sadakati, in vitro koşullarda M13mp2 DNA'sının lacZ ? genini içeren tek iplikli boşluğunu DNA sentezi ile tamamlarken yaptığı hataları ölçebilen iki farklı deney sistemi ile, 37°C, 50°C ve 72°C sıcaklıklarında incelenmiştir. Enzimin baz değişimi hataları sıcaklık 37°C'tan 72°C'a çıkartıldığında üç kat artış göstermiştir. Faj mutantlarının DNA dizi analizi yapıldığında, baz değişimlerinin bazılarının sıcaklığa daha duyarlı olduğu gözlemlenmiştir. En çok görülen baz değişimi kalıp G bazının karşısına dGMP yanlış nükleotidinin eklenmesidir. GF DNApolI enziminin tek bir nükleotidi ekleme hızı ?pre-steady state? koşullarda 22°C, 37°C ve 50°C sıcaklıklarında ölçülmüştür. Doğru ve yanlış nükleotidin ekleme hızı (kpol) sıcaklık 22°C'tan 50°C'a yükseltildiğinde doğru nükleotid için 7 kat ve yanlış nükleotid için 4 kat artış göstermiştir. Her iki nükleotid için, enzimin bağlanma sabiti (Kd) çok az değişim gösterirken, enzimin verimliliği (kpol/Kd) söz konusu sıcaklık değişiminde 5 kat artmıştır.

Özet (Çeviri)

The DNA polymerase I genes of seven newly identified Geobacillus species within the family Bacillaceae, were cloned, sequenced and overexpressed in Escherichia coli. The polA gene of these species encodes DNA polymerase I of 878 amino acid residue protein with a predicted molecular weight of 99.3 kDa. Similarity analyses suggested that DNA polymerases belong to family A polymerases and lack 3'-5' exonuclease activity. The complete coding sequences of the genes were submitted into the GenBank. The recombinant (His)6-tagged DNA polymerases were purified by Ni2+-affinity chromatography and the homogeneous proteins were obtained after TEV protease digestion. DNA polymerases from Geobacillus anatolicus (Gana DNApolI) and Geobacillus kaue strain NB (Gkaue DNApolI) were further characterized in vitro and optimum conditions with respect to temperature, pH, monovalent and divalent ions were determined. Geobacillus DNA polymerase I fragment (GF DNApolI) was cloned and purified after homology modeling using Bacillus DNA polymerase I fragment (BF) as the model protein structure. The accuracy of GF DNApolI was measured by two M13 based fidelity assays which score errors produced during in vitro DNA synthesis of the lacZ ? complementation gene in M13mp2 DNA at 37°C, 50°C and 72°C. Base substitution errors increase three-fold when temperature is raised from 37°C to 72°C. DNA sequencing of the phage mutants showed that some of the base substitutions are more temperature sensitive than others. The most common base substitution error is the misincorporation of dGMP opposite to template G. Single nucleotide incorporations for both correct and for incorrect nucleotides were also studied under single-turnover conditions at 22°C, 37°C and 50°C. For both correct and incorrect dNTP insertions, the rate of polymerization, kpol, increased (seven- and four-fold, respectively) when temperature is raised from 22°C to 50°C, whereas only a slight change in Kd was observed. As a result, kinetic efficiency of the enzyme (kpol/Kd) shows five-fold increase over this temperature range.

Benzer Tezler

  1. Discovery of novel enzymes using proteomic approaches

    Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi

    MERVE ÖZTUĞ KILINÇ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ

  2. Anoxybacillus flavithermus WK1 AfCDA geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve biyokimyasal karakteriasyonu

    Cloning, expression, purification and enzymatic characterization of AfCDA gene from Anoxybacillus flavitheermus WK1

    AYŞENUR EMİNOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    BiyokimyaRecep Tayyip Erdoğan Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CEMAL SANDALLI

  3. Termofilik geobacıllus Sp. TF16'dan ksilanazın klonlanması, ekspresyonu, immobilizasyonu, karakterizasyonu ve endüstriyel uygulamalarının incelenmesi

    Cloning, expression, immobilisation, characterization of xylanase from Thermophilic geobacillus Sp. TF16 and investigation of industrial applications

    ÜMMÜHAN ÇAKMAK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    BiyokimyaKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NAGİHAN SAĞLAM ERTUNGA

  4. Candida diddensiae format dehidrogenaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu

    Recombinant expression and characterization of Candida diddensiae formate dehydrogenase enzyme

    EDA ARSLAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyokimyaYıldız Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. EMEL ORDU

  5. Biyoetanol üretimi için Thermotoga naphthophila'dan β-ksilanazın moleküler klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu

    Molecular cloning, expression and characterization of β-xylanase from Thermotoga Naphthophila for bioethanol production of bioethanol

    ÖZGENUR DİNÇER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyoteknolojiBartın Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AHMET KARADAĞ

    PROF. DR. KEMAL BÜYÜKGÜZEL