Hücre kültürü pasajlarının PPR virus P geni düzeyinde etkisinin araştırılması ve tanısal amaçlı gerçek zamanlı reverz transkritaz polimeraz zincir reaksiyonu (rtRT ? PCR) protokollerinin geliştirilmesi
The investigation of the effects of cell culture passages on the PPR virus P gene and development of realtime reverse transcriptase polymerase chain reaction (rtRT ? PCR) methods for diagnostic purposes
- Tez No: 275464
- Danışmanlar: PROF. DR. AYKUT ÖZKUL
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2010
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ankara Üniversitesi
- Enstitü: Biyoteknoloji Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 75
Özet
Peste Des Petits Ruminants (PPR), paramyxoviridae ailesinde, morbillivirus alt grubunda yer alan, hayvansal gıda üretiminin önemli bir bileşeni olan küçük ruminantların Asya ve Afrika` da artan öneme sahip, yüksek enfeksiyöz ve bulaşıcı karekterde hızlı yayılım gösteren önemli viral bir hastalığıdır. Hastalık çoğu gelişmekte olan Asya ve Afrika ülkelerinde endemiktir ve % 90'a varan mortalite oranı ile seyreden salgınlar oluşturmaktadır. Etkenin teşhisine yönelik farklı serolojik ve moleküler teknikler zaman içinde önemli ilerlemeler kaydetmiştir. Etkenin en kısa zamanda ve en yüksek doğrulukta ortaya konması için geliştirilen en önemli tekniklerden biri `gerçek zamanlı' PCR sistemidir.Çalışmamızda kullanılan primer ve prob tasarımları tamamen 2001 yılında Türkiye'de izole edilen ve genom sekansı gen bankasına girilen PPRV/TU00 izolatı üzerinden yapıldı. PPRV'e ait olan N, P, L ve M gen bölgelerine spesifik primer ? prob tasarımlarını kullanarak tek adımda viral RNA'nın kantitatif olarak tesbitinin gerçekleştirilmesi amaçlandı. Buna yönelik olarak, anabilim dalımıza farklı zamanlarda ulaşan ve konvansiyonel RT-PCR testi ile pozitif bulunmuş olan 45 adet koyun ve keçiye ait kan, serum ve organ numuneleri kullanıldı. PPRV RNA'sının kantitasyonu için in vitro transkripsiyon ve enfektif partikül sayısı bilinen virus sulandırmaları kullanıldı. Plasmidlerden cRNA eldesi sırasında yaşanan sorundan dolayı titresi bilinen virus RNA `sının bilinen miktarda oluşturulan örneklerin döngü eşik değerlerine karşılık başlangıçtaki kopyalarının logaritmik konsatrasyonlarının olduğu standart doğrular oluşturuldu. Yapılan denemelerde L gen bölgesine spesifik primer ? prob dizaynları ile L geni için 1,65 × 101, P geni için 5,88 , M geni için 1,01× 101 ve N geni için 1,73 × 103 kopya/ml`ye kadar saptanabildiği gözlendi.Bununla beraber hastalığın çok ciddi sıkıntılar oluşturması uygun, etkin, sorunsuz aşı geliştirilmesine yönelik çalışmaların artmasına yol açmıştır. Çalışmamızın ikinci ayağı olarak virusun hücre kültürlerinde pasajlanması sonucu PCR ile çoğaltmış olduğumuz P geninde meydana gelen değişimlerin dizin analizi metodu yardımıyla incelenmesi ve tesbiti gerçekleştirildi. Ancak dizinler arasında değişimler gözlenmedi ve dizinlerin stabil oldukları tesbit edildi.
Özet (Çeviri)
Peste Des Petits Ruminants (PPR) also known as sheep plague, caused by an agent belongs to morbillivirus genus of paramyxoviridae family, is a significant infectious, contagious, fast-spreading disease of the small ruminants which are the important source of livestock, with an increasing importance in Asia and Africa. The disease has an endemic course and outbreaks with 90% mortality rate can occur in most of the developing countries of Asia and Africa. There has been a significant progress in serological and molecular techniques for the diagnosis of the agent. One of the most considerable techniques which were developed to diagnose the agent in the shortest time period and also with the highest accuracy is Real time PCR. This is a rapid system to quantify the amplified products with a high sensitivity and certainty.The primers and probs used in this study were designed on the genome of the isolate PPRV/TU00 which was isolated in 2001 in Turkey and submitted on gene bank. We aimed the one step quantitative determination of viral RNA by using the primer and probs specific for N, P, L and M genes of PPRV. For this purpose blood, sera and tissue (organ) samples belong to 45 sheep and goat which were received by our department and found to be positive by using PCR were used. For quantitation of RNA of PPRV; each gene region was cloned into plasmids. Also dilutions of a virus of known titer was used for quantitation incase of the problems which can occur at this stage. Trials have showed that it is possible to detect with L gene specific primers and prob designs; for L gene; 1, 65 × 101, for P gene; 5, 88 , for M gene; 1, 01× 101 and for N gene; 1, 73 × 103 copy/ml. Due to the problem took place during cRNA acquisition from plasmids standard curves were created which have cycling threshold values of known amount of RNA samples from the virus of known titer correlative to logarithmic concentrations of starting copies. In addition because of the severity of the disease, the number of the studies, on developing suitable, efficient, trouble-free vaccines has increased.At the second stage of our study the changes on P gene as a result of passaging the virus in cell cultures which was amplified by PCR were examined by sequence analysis method. However no changes were observed amongst sequences and it was decided that the sequences are stable.
Benzer Tezler
- Theileria annulata'nın hücre kültürü pasajlarında atenüasyon düzeylerinin moleküler belirteçler ile incelenmesi
Investigation of attenuation levels of theileria annulata in cell culture passages with molecular markers
BERİL KOÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
ParazitolojiAydın Adnan Menderes ÜniversitesiParazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HÜSEYİN BİLGİN BİLGİÇ
PROF. DR. TÜLİN KARAGENÇ
- Aşı suşu olarak kullanılacak şap virusu plak morfolojisindeki farklılıkların genetik olarak incelenmesi
Genetical investigation on the differences of plaque morphology of fmdv which will be used as vaccine strain
MÜGE FIRAT SARAÇ
- Primer bronş epitel hücre kültürlerinde progenitör/kök hücre ekspresyonu ve pasajlamanın etkisi
Progenitor/stem cell expression in bronchial epithelial cell cultures and the effect of passaging
NURAY BAYAT
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2012
Histoloji ve EmbriyolojiGaziantep ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HASAN BAYRAM
YRD. DOÇ. DR. AYHAN ERALP
- Diş çürüğünün uzaklaştırılmasında kullanılan 3 farklı kimyasal ajanın sitotoksisitenin in vitro ve in vivo koşullarda değerlendirilmesi
The in vitro and in vivo comparison of the cytotoxicity of three different chemical tooth caries removal agents
ÇİĞDEM ŞEKERCİ
- İnsan akut promyelositik lösemi hücre serilerinde (HL 60) allium sativum (sarmısak)'un farklı ekstre ve preparatlarının hücrenin oksidan/antioksidan durumu ile hücre büyümesi üzerine olan etkilerinin incelenmesi
The effects of different preparations of garlic (allium sativum) on oxidant/antioxidant status and cell growth on human acute promyelocytic leukemia cell line (HL 60)
YASEMİN GÜLGÜN İŞGÖR
Doktora
Türkçe
2002
BiyokimyaAnkara ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF.DR. MESUDE İŞCAN
PROF.DR. İLKER DURAK