Selective quantification of viable Escherichia coli cells in biosolids upon propidium monoazide treatment by quantitative PCR
Biyokatılardaki canlı Escherichia coli miktarının propidyum monoazid işlemi ile kantitatif polimeraz zincir reaksiyon (Q-PCR) yöntemi kullanılarak belirlenmesi
- Tez No: 285683
- Danışmanlar: DOÇ. DR. AYŞE GÜL GÖZEN, DOÇ. DR. METİN DURAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bölümü
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 98
Özet
Escherichia coli gibi fekal koliformlar atık yada gübre olarak kullanılan biyokatılarda bulunan ve halk sağlığı açısından önem taşıyan dışkıya ait patojen miktarını belirlemede oldukça sık kullanılan indikatör mikroorganizmalardır. Yakın zamana kadar anaerobik öğütmenin patojen ve fekal koliform sayısını azaltmakta kullanılan en etkili yöntemlerden biri olduğu düşünülüyordu. Fakat son zamanlardaki çalışmalar, çoğalabilme yetilerini kaybetmiş fakat canlı olan indikatör mikroorganizmaların yüksek hızlı santrifüj yontemi ile susuzlaştırılan biyokatı örneklerinde yeniden çoğalabilme ve aktifleşme safhasına girdiğini göstermiştir.Bu nedenle biyokatı örneklerindeki canlı indikatör mikroorganizmaların klasik kültür yöntemi kullanılmaksızın ölü olanlarından ayırt edilebilmesi ve miktarlarının belirlenmesi halk sağlığı açısından büyük önem taşımaktadır. DNA yapısının hücre ölümünü takiben günlerce hatta haftalarca bozulmaması DNA-bazlı teknikleri canlı hücreleri yansıtmakta yetersiz bırakmaktadır. Ethidiyum monoazid (EMATM) ve propidyum monoazid (PMATM) gibi boyalar, yüksek oranda DNA molekülüne bağlanabilme özelliği olan ve sadece hücre zarı bütünlüğünü yitirmiş ölü hücrelere nüfuz eden fotoreaktif moleküllerdir. Hücre içerisinde ışığa mağruz kalarak fotolize olan PMATM molekülleri DNA molekülüne kovalent bağ ile kimyasal olarak bağlanarak zincirleme polimeraz reaksiyonunu (PCR) engellemektedir. Dolayısıyla PMATM ile modifiye edilmiş örneklerin kantitatif zincirleme polimeraz reaksiyonu (qPCR) sonuçları sadece hücre zarı bozulmamış canlı hücreleri yansıtacaktır. Şimdiye kadar PMATM pek çok çalışmada, farklı mikrorganizmalar kullanılarak test edilmiş olup, biyokatı gibi kompleks çevresel maddelerde yeterince değerlendirilmemiştir. Bu bilgiler doğrultusunda çalışmalarımız bioyokatılardaki canlı Escherichia coli ATCC 25922 miktarının PMATM modifikasyonu ile uidA geni hedef alınarak kantitatif polimeraz zincirleme reaksiyonu yöntemi kullanılarak belirlenmesini içermektedir. Çalışmalarımız belirli ve bilinen oranlarda canlı ve ölü hücre içeren karışımlarda PMA uygulamasının ölü hücrelerden gelen amplifikasyonu % 99 oranında inhibe ettiğini göstermiştir. Ayrıca PMA uygulamalı kantitatif polimeraz zincirleme reaksiyon yönteminin 2000 mg/L ve altı toplam askıda katı madde içeren biyokatı örneklerine de başarıyla uygulanabileceği ilk defa gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
Density of fecal coliforms (FC) such as Escherichia coli is the most commonly used indicator of fecal pathogen content of biosolids. When biosolids are disposed off or used for soil amendment, they pose public health risks. So far anaerobic digesters have been considered to be an effective treatment option for pathogen and FC reduction in biosolids. However, recent studies revealed that there is a significant re-growth and reactivation of indicator organisms in biosolids upon dewatering by centrifugation. Although the exact mechanism of FC reactivation is yet to be understood, a few extensive recent studies strongly suggest that FC go into a viable but non-culturable (VBNC) state during anaerobic digestion.Therefore, quantitative detection of live cells among the total in biosolids samples, without using culturing-based approaches, is highly critical from a public health risk assessment perspective. Since recent investigations proved the significant re-growth and reactivation of indicator organisms. Persistence of DNA in the environment after cell death in the range of days to weeks limits the application of DNA-based approaches for the detection of live bacteria. Using selective nucleic acid intercalating dyes such as ethidium monoazide (EMA) and propidium monoazide (PMA) is one of the alternative approaches to detect and quantify the viable cells by quantitative PCR. These compounds have the ability to penetrate only into dead cells with compromised membrane integrity. They intercalate in the DNA via photo-inducible azide groups and in turn inhibit DNA amplification during PCR reactions. PMA has been successfully used in different studies and microorganisms but it has not been evaluated sufficiently for the complex environmental samples such as biosolids. In this study Escherichia coli ATCC 25922 and uidA gene were used as model organism and as target sequence respectively in absolute quantification method with real-time PCR. Experiments with the known quantities of live and dead cell mixtures showed that PMA treatment inhibits PCR amplification from dead cells with over 99% efficiency. The results of this study conclusively demonstrated that PMA-modified PCR could be successfully applied to the biosolids when total suspended solid (TSS) concentration is 2000 mg/L or below.
Benzer Tezler
- Disiplinlerarası ilişkiler bağlamında medikal illüstrasyonun nazal cerrahi eğitimindeki yeri – fotoğraf ve yazılı anlatım ile karşılaştırılması
The place of medical illustration in nasal surgery regarding the interdisciplinary relationships and its comparison with photography and written expression
SEFA ERSAN KAYA
Doktora
Türkçe
2020
Güzel SanatlarOndokuz Mayıs ÜniversitesiGüzel Sanatlar Eğitimi Ana Bilim Dalı
PROF. SEVGİ SOYLU KOYUNCU
- Karbon nanotüp ve nanomateryal-temelli modifiye elektrotlarla enerjetik maddelerin voltametrik tayini
Voltammetric determination of energetic materials with carbon nanotube and nanomaterial-based modified electrodes
AYSU ARMAN
- Metal organik kafes yapılarının diol içeren biyomolekül tayini ve izolasyonu için kullanılabilirliğinin incelenmesi
Investigation of the usability of metal organic frameworks structures for detection and isolation of diol containing biomolecule
SEHER PARLAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Kimya MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATOŞ ÇİĞDEM KİP
- Nanomalzeme kaplı elektrokimyasal sensör yardımıyla oral antidiyabetik ilaçların voltametrik miktar tayini
Voltammetric quantification of oral antidiabetic drugs with the help of nanomaterial coated electrochemical sensor
BERFİN ŞAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Eczacılık ve FarmakolojiAnkara ÜniversitesiAnalitik Kimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN ERK
- Turunçgil phytophthora türlerinin topraktaki populasyon yoğunluklarının saptanmasında kullanılabilecek yöntemlerin araştırılması
The Isotation techniques used for enumeration ad quantification of phytophthora specis in citrus soils
FİGEN MERT