Evaluating microemulsions for purification of beta-galactosidase from Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactis beta-galaktozidazının saflaştırılması için mikroemülsiyonların değerlendirilmesi
- Tez No: 285684
- Danışmanlar: PROF. DR. HALUK HAMAMCI
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Gıda Mühendisliği, Biotechnology, Food Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2010
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Bölümü
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 137
Özet
Bu çalışmada, beta-galaktosidaz'ın (laktazın) diğer proteinlerden ayrılması için yağ içerisinde su mikroemülsiyonlarının kullanılma potansiyelini değerlendirdik. Beta-Galaktosidaz'ın süt karbonhidratı laktozu parçalayabilme özelliği bu enzime dikkate değer ticari bir önem vermektedir. Kluyveromyces lactis'den hazırlanmış ticari bir beta-galaktosidaz preparatının, izooktan içinde 200 mM bis (2-ethylhexyl) sodium sulfosuccinate (AOT) den oluşturulmuş mikroemülsiyon su damlacıkları içinde çözünme derecesi tampon çeşidi, pH, iyon gücü ve protein konsantrasyonunun fonksiyonu olarak ölçülmüştür. Elde ettiğimiz sonuçlar, beta-galaktosidaz'ın büyük molekül ağırlığından dolayı (MA ~ 220-240 kDa, dimeric formu) bu enzimin mikroemülsiyon su damlacıkları tarafından büyük ölçüde çok düşük tuz konsantrasyonları altında absorplandığını göstermiştir. Bu sonuçlara dayanarak, tek-aşamalı bir ayırma yöntemi geliştirdik, bu yöntemde protein karışımı içeren düşük hacimli su bazlı tampon, organik bir yüzey aktif madde çözeltisine eklenmiştir. Mikroemülsiyon su damlacıkları yağ içerisinde oluşur ve büyük molekül ağırlığına sahip istenen proteinleri dışarıda bırakırken küçük molekül ağırlıklı protein safsızlıklarını yakalar. Bu beta-galaktosidaz'ın yeni oluşan su fazı içine atılmasına neden olur. Bu yöntemin bir biyo-ayırma aracı olarak uygulanabilirliliği beta-galaktosidaz ve test proteini beta-laktoglobulini eşit miktarda içeren besleme karışımı üzerinde gösterilmiştir. Bu iki proteinin birbirinden ayrıştırılması ve geri kazanımı tampon çeşidi, pH, iyon gücü ve protein konsantrasyonunun fonksiyonu olarak incelenmiştir. Sonuçlar, ayırmanın 100 mM KCl tuz konsantrasyonunda büyük ölçüde tamamlandığını göstermiştir, bu noktada su damlacıkları beta-laktoglobulini taşıyacak kadar büyük fakat laktaz için çok küçüktür. 100 mM tuz konsantrasyonunda neredeyse saf bir şekilde toplam laktaz aktivitesinin % 92'si geri kazanıldı.Aynı ayırma planı daha sonra Kluyveromyces lactis mayası hücrelerinden elde edilen ham özüt üzerinde de denenmiştir. Ayırma yöntemimizde besleme olarak kullanılan ham özüt, K. lactis maya hücrelerinin boncuklu hücre kırıcı ile parçalanmasıyla elde edilmiştir. % 96 aktivite geri kazanımı ile birlikte özütün 5.4 katı saflaştırma faktorüne ulaşılmıştır. Bu sonuçlar tek-aşamalı ayrıma yöntemimizin beta-galaktosidaz'ın teknik enzim olarak üretimi için dikkate değer bir yöntem olduğunu göstermiştir: bu yöntem aşağı-akış işlemlerinde gereksinim duyulan işlem basamaklarını azaltma potansiyeli nedeniyle enzimin, sürekli bir sistemde, büyük ölçekli kısmi saflaştırılmasının gerçekleştirilmesi potansiyeline sahiptir.
Özet (Çeviri)
In this study, we evaluated the potential of water-in-oil microemulsions for the separation of beta-galactosidase (lactase) from other proteins. The ability of beta-galactosidase to break down the milk carbohydrate lactose gives the enzyme considerable commercial importance. The extent of solubilization of a commercial Kluyveromyces lactis preparation of beta-galactosidase into microemulsion droplets formed from 200 mM bis (2-ethylhexyl) sodium sulfosuccinate (AOT) in isooctane was measured as a function of buffer type, pH, ionic strength, and protein concentration. Our results showed that, due to the large molecular weight of beta-galactosidase (MW~ 220-240 kDa, dimeric form), the enzyme was taken up by the microemulsion droplets mainly under very low salt conditions. Based on these results, we designed a one-step separation procedure, in which a small volume of aqueous buffer containing the protein mixture is added to an organic surfactant solution. Microemulsion droplets form in the oil and capture protein impurities of smaller molecular weights, while excluding the high molecular weight target protein. This causes the beta-galactosidase to be expelled into a newly formed aqueous phase. The feasibility of this one-step process as a bioseparation tool was demonstrated on a feed consisting of an equal mixture of beta-galactosidase and the test protein beta-lactoglobulin. Recovery and separation of the two proteins was analyzed as function of buffer type, pH, ionic strength, and protein concentration. Results showed that separation was most complete at 100 mM KCl salt concentration, where the droplets were big enough to carry beta-lactoglobulin but too small for lactase. At 100 mM salt concentration, we recovered 92% of the total lactase activity in a virtually pure form.The same separation scheme was then tested on crude extract obtained from a cell culture broth of the yeast Kluyveromyces lactis. Cells of the yeast K. lactis were disrupted by minibeadbeater, forming a crude extract that was used as the feed in our separation process. A 5.4-fold purification factor of the extract was achieved, with 96% activity recovery. The results showed our one-step separation process to be an interesting method for the production of beta-galactosidase as a technical enzyme: it has the potential to achieve a continuous, large-scale partial purification of the enzyme, potentially reducing the number of steps required in downstream process.
Benzer Tezler
- Doğal kaynaklardan glutatyon elde edilmesi, saflaştırılması ve farmasötik formda değerlendirilmesi
Purification of glutathione obtained from natural sources and evaluation in pharmaceutical form
FATMANUR BOSTAN
Doktora
Türkçe
2024
BiyomühendislikDüzce ÜniversitesiDoğal ve Bitkisel Ürünler
PROF. DR. UFUK KOCA ÇALIŞKAN
- Çörek otu yağı kaynaklı antiinflamatuar etkili mikroemülsiyon göz formülasyonlarının hazırlanması ve değerlendirilmesi
Preparation and evaluation of anti-inflammatory microemulsion eye formulations from black seed oil
GÖRKEM TIRANBEŞLİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
Eczacılık ve FarmakolojiTrakya ÜniversitesiFarmasötik Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ GÜLŞAH GEDİK
- Diflukortolon valerat yüklü topikal mikroemülsiyon formülasyonlarının geliştirilmesi ve ın vitro değerlendirilmesi
Development and in vitro evaluation of diflucortolone valerateloaded topical microemulsion formulations
ELİF PINAR ÖZALP
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Eczacılık ve Farmakolojiİstanbul ÜniversitesiFarmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MERYEM SEDEF ERDAL
- Metronidazol içeren kozmetik amaçlı topikal mikroemülsiyon formülasyonunun geliştirilmesi ve in vitro-in vivo değerlendirilmesi
The development of topical microemulsion formulation containing metronidazole for cosmetically use and its in vitro/in vivo evaluation
AYŞE GÜL KAYIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2002
Eczacılık ve FarmakolojiGazi ÜniversitesiFarmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Y.DOÇ.DR. FİGEN OCAK
- Salisilik asit içeren kozmetik amaçlı mikroemülsiyon formülasyonlarının hazırlanması ve klinik olarak değerlendirilmesi
Preparation and clinical evaluation of microemulsion formulations containing salicylic acid for cosmetic purpose
UMUT BARIŞ DENİZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2001
Eczacılık ve FarmakolojiAnkara ÜniversitesiFarmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. NİLÜFER TARIMCI