Geri Dön

Rekombinant DPP IV enziminin Sf9 hücreleri kullanılarak biyoreaktörde üretimi ve karakterizasyonu

Production and characterization of recombinant DPP IV enzyme in bioreactor by using Sf9 cells

PDF İndir

  1. Tez No: 291056
  2. Yazar: ÖZLEM ÜSTÜN
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. GAYE ÖNGEN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2011
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ege Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 257

Özet

Çalışmamızda eksikliğinde insan vücudunda metabolizmanın normal seyrini etkileyebilecek önemli hastalıkların baş gösterdiği gastrointestinal, nörolojik, endrokrinolojik, immunolojik pek çok işlevi bulunan insan Dipeptidil Peptidaz IV (DPP IV) enzimi Sf9 hücre hattında baculovirus kullanılarak rekombinant olarak üretilmiştir.Rekombinant insan DPP IV enzimi öncelikle Sf9 vektörü olan pFastBac1 plazmidine aktarılmış ve daha sonra DH10Bac hücresi içinde baculoviral DPP IV elde edilmiştir. Sf9 hücrelerinin baculoviral insan DPP IV ile enfeksiyonu sonucunda üretilen DPP IV enzim aktiviteleri karşılaştırılarak transfeksiyon için uygun enfeksiyon katsayısı (MOI) 0,1 ve transfeksiyon zamanı 96 saat olarak belirlenmiştir. Transfeksiyonun 120.saatindeki DPP IV enzim aktivitesi değeri ile aynı saatteki enfekte olmamış Sf9 hücresinin DPP IV enzim aktivitesi değeri arasında 35,2 katlık fark bulunmuştur. Bu enfeksiyon katsayısı kullanılarak yapılan `Virüs replikasyonu ve sitopatik etkisinin incelenmesi' denemesi sonucunda baculovirusun Sf9 hücrelerine litik etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Çalışmalarımızda 0.saatte enfekte olmayan ve enfekte olan Sf9 hücrelerinin büyüklükleri arasında anlamlı bir fark bulunmazken 24.saatten sonra bu iki bağımsız örneklem arasında anlamlı bir farklılık olduğu görülmüştür.Büyük ölçekte üretim çalışmalarımız için yapılan çalkalamalı griftli kültür erlenlerinde Sf9 hücrelerinin spesifik büyüme hızı 0,03 h-1 (0,73 gün-1) ve ikilenme süresi 22,5 h olarak hesaplanmıştır. Bu veriler ile beraber üretim ortamının reolojik özelliklerine dayanarak ölçek büyütme prosesinin parametreleri olan biyoreaktör içine verilen kabarcıkların boyutu, havalandırma hızı, spesifik ölüm hızı, Reynolds sayısı, Güç sayısı hesaplanmıştır.Büyük ölçekteki üretimler 1,5 litre ve 3 litre için gerçekletirilmiş ve üretim boyunca izlediğimiz oksijen tüketimlerinin sırası ile enfekte olmamış Sf9 hücre hattı için 1,5 litrelik biyoreaktörde 1,8x10-10 mgO2/hücre.dk, baculovirus inokülasyonundan 72 saat sonra hücre başına düşen spesifik oksijen tüketim hızı miktarı 2,9 x10 -10 mgO2/hücre.dk olarak hesaplanmıştır. Üretimin değeri 0,0133 dk-1 olarak bulunmuştur. Biyoreaktördeki üretim sona erdiğinde Sf9 hücrelerinin % 96'sında DPP IV ekspresyonu tespit edilmiş ve molekül ağırlığı 76 kDa olarak belirlenmiştir. 3 litrelik üretimde enfekte olmamış Sf9 hücre hattı için 3 litrelik biyoreaktörde spesifik oksijen tüketim hızı 7,27x10-11 mgO2/hücre.dk (3,75 x10 -17 mol/hücre.s) baculovirus inokülasyonundan 72 saat sonra hücre başına düşen spesifik oksijen tüketim hızı miktarı 1,12 x10 -10 mgO2/hücre.dk ve üretimin değeri 0,0129 dk-1 olarak hesaplanmıştır. Biyoreaktördeki üretim sona erdiğinde Sf9 hücrelerinin % 90'ında DPP IV ekspresyonu tespit edilmiştir.Üretim sonunda 1,5 litrelik üretim (3,4 mU/ml.saat) ve 3 litrelik üretim (2,98 mU/ml.saat) verimlilik açısından karşılaştırıldıklarında üretim verimliliklerinin yakın olduğu görülmüştür. Üretimler tamamlandıktan sonra DPP IV proteini iyon değiştirici ve moleküler elek kromatografilerinin optimizasyonları sağlandıktan sonra %24,5 `luk bir verim ile 487 kat saflaştırılabilmiştir. Ayrıca moleküler elek kromatografisi sonuçlarına göre denatüre olmamış DPP IV'ün molekül ağırlığı yaklaşık 136 kDa (dimer) olarak hesaplanmıştır.Çalışmamız sonucunda elde edilen DPP IV enzim aktivitesi ve verimlilik değerleri Sf 9 hücre hattı kullanılarak büyük ölçekte rekombinant DPP IV üretiminin başarılı bir şekilde yapıldığını göstermektedir.

Özet (Çeviri)

The recombinant DNA technology is a groundbreaking theme in industrial area such as productions of biotechnological vaccines, antibiotics, hormones and monoclonal antibodies. Dipeptidyl Peptidase IV (DPP IV) enzyme is in hydrolase class and shows many activities in different parts of human body. Deficiency of DPP IV causes some disorders in gastrointestinal, neurologic, endocrinological and immunological systems.In this study, DPP IV enzyme was produced via recombinant DNA technology using Sf9 cell line in bioreactor. Recombinant human DPP IV gene was transferred to pFastBac1 plasmid and baculoviral DPP IV was then generated in DH10Bac cell. After the infection o Sf9 cell line with baculoviral human DPP IV, enzyme activities were compared for determining the transfection time and amount of virus used for infection. The optimum multiplicity of infection (MOI) and transfection time were determined 0.1 and 96 hours, respectively. The significant difference of DPP IV enzyme activity, 35.2-fold, was observed between infected and uninfected Sf9 cells in 120th hour in transfection. Baculovirus has no lytic activity to Sf9 cell lines, according to virus replication and investigation of cytopathic effect assay based on MOI. Cell size of infected cells was started to increase after 24 hours of infection depend on uninfected cells.Specific growth rate and doubling time of Sf9 cells were calculated as 0.03 h-1 (0.73 day-1) and 22.5 h in shake flasks. These data and characteristic values of medium such as viscosity and density were used in calculation scale-up process in terms of bubble diameter, aeration rate, specific death rate, kLa, Reynolds number and Power number. Large scale productions of Sf9 cell line were performed in 1.5- and 3-L bioreactors. Specific oxygen consumption rate was monitored in uninfected cells and cells at 72nd hour after infection in 1.5-L and 3-L bioreactors. It was increased from 1.8x10-10 mgO2/cell.min in uninfected cells to 2.9x10-10 mgO2/cell.min at 72nd hour after inoculation in 1.5-L bioreactor. Meanwhile, 7.27x10-10 mgO2/cell.min and 1.12x10-10 mgO2/cell.min were determined in 3-L bioreactor, respectively. Oxygen mass transfer coefficient (kLa) was calculated as 0.0133 min-1 and 0.0129 min-1 in 1.5-L and 3-L bioreactors. DPP IV expression was observed in 96% and 90% of total cells after 1.5-L and 3-L productions and molecular-weight of DPP IV was determined 76 kDa with SDS-PAGE method in both productions. Productivity values of 1.5-L and 3-L productions were 3.4 and 3.0 mU/ml.h, respectively.Ion exchange and molecular-size chromatographies were used in purification steps of DPP IV in large scale productions. Purification process was successfully achieved with 24.5% yield and 487-fold purified product based on crude enzyme activity. Molecular-weight of DPP IV was determined 136 kDa (dimer) using molecular-size chromatography.Productivity of processes and activities of DPP IV values after large scale productions showed that recombinant DPP IV was successfully prepared in Sf9 insect cell lines and produced in large scales.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    413494

    Rekombinant böcek iridovirüsünün oluşturulması ve karakterizasyonu

    Construction and characterization of a recombinant insect iridovirus

    ARZU ÖZGEN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. REMZİYE NALÇACIOĞLU

  2. Tez No

    414074

    Rekombinant insan insulin peptidinin bakteriyal ekspresyon sistemi kullanarak üretimi

    Expression of recombinant human insulin in bacterial expression systems expression systems

    CEREN CAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. EVREN DORUK ENGİN

  3. Tez No

    414094

    Rekombinant insan interferon gama peptidinin bakteri ekspresyon sistemleri kullanarak üretimi

    Expression of recombinant human interferon gamma in bacterial expression systems

    PELİN KOLÇAK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. EVREN DORUK ENGİN

  4. Tez No

    419859

    Rekombinant FSH (folikül stimüle edici hormon) kullanılarak antagonist protokol ile koh (kontrollü ovaryen hiperstimülasyon) yapılan hastalarda antagonist başlama gününde hphmg (yüksek oranda saflaştırılmış human menopozal gonadotropin) eklenmesinin siklus başarısına etkisi

    The effect of addition of hphmg (highly purified human menopausal gonadotrophin) on the day of antagonist initiation in patients undergoing coh (controlled ovarian hyperstimulation) using an antagonist protocol with recombinant fsh (follicle-stimulating hormone)

    ÖZGÜR KAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    Kadın Hastalıkları ve DoğumAnkara Üniversitesi

    Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MURAT SÖNMEZER

  5. Tez No

    880335

    Komagataella phaffii'de ısı ile indüklenebilir bir heterolog protein ekspresyon sisteminin geliştirilmesi ve azurin proteininin üretimi

    Improvement of a heat-inducible heterologous protein expression system and production of azurin protein in Komagataella phaffii

    İBRAHİM DAĞCI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyoteknolojiAtatürk Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. YAĞMUR ÜNVER

    PROF. DR. AHMET MAVİ

Geri Dön