CALB (Candida antarctica lipase B) immobilization on APTMS activated carrier via cross-linking method
APTMS ile aktive edilmiş taşıyıcıya CALB'nin (Candida antarctica lipase B) çapraz bağlama yöntemi ile immobilizasyonu
- Tez No: 465467
- Danışmanlar: PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 95
Özet
Enzimatik katalizleme işlemlerinin polimer sentezlerinde kullanılması, steryokimya, kimyasal-seçicilik ve bölgesel seçicilik üzerinde kontrol sağlanabilmesi nedeni ile son yollarda dikkat çekmektedir. Organik sentezden farklı olarak, enzimatik polimerizasyon nontoksik, biyo-uyumlu ve biyo-bozunabilir ürünler sağlar. Bu gibi avantajların doğrultusunda, enzimatik polimerizasyon sonucu elde edilen ürünler biyomedikal mühendislik, ilaç salınım sistemleri, doku ve organ nakilleri gibi tıbbi uygulamalarda geniş kullanım alanı bulmaktadırlar. Diğer önemli bir nokta olarak, seliloz, kitin, ksilan, ve hiyalüronik asit gibi bazı polimerik ürünler sadece enzimatik polimerizasyon ile başarılı bir şekilde üretilebilirler. Polikaprolakton, diğer biyo-polimerlere kıyasla uygun bozunma hızlarına ve kontrol edilebilir gözenek yapısına sahip olduğu için ilgi odaği olmuştur. Kristallenebilirliği, molekül yapısına bağlı olarak %69 oranına kadar ulaşabilmektedir. Mölekül ağırlığı azaldıkça kristal yapısında artık gözlemlenmektedir. Bu şekilde, mekanik ve termal özelliklerinin yanı sıra fiziksel yapısı da molekül ağırlığına bağlıdır. Molekül ağırlığı 530 ve 630 000 g/mol arasında değişmektedir. Polikaprolaktonun diğer bir önemli özelliği ise, polilaktik asit, polivinil klorür, polibisfenol-A gibi çeşitli polimerler ile iyi karışabilirlik göstermesidir. Polikaprolakton aynı zamanda üretim açısından kolay ve tıbbi uygulamalarda yapı iskeleti olarak çeşitli tiplerde bulunabilen bir üründür. Bu sebeple, doku mühendisliğinde geniş kullanım alanına sahiptir. Farklı kaynaklardan çeşitli lipazlar arasında Candida antartica lipaz B (CALB) ɛ-kaprolakton polimerizasyonunda yüksek katalitik etki göstermektedir. Polikaprolaktonun enzimatik polimerizasyonu polikondenzasyon ve halka açılma polimerizasyonu olarak iki farklı mekanizmada gerçekleşebilir. Polikandenzasyon reaksiyonlarında düşük moleküllü ürün eldesinin yanı sıra reaksiyon sırasında ortaya çıkan yan ürünlerin uzaklaştırılması da dezavantaj olarak değerlendirilmektedir. Polykondenzasyon reaksiyonlarının bu gibi dezavantajlarından dolayı halka açılma polimerizasyon mekanizması daha ön plana çıkmaktadır. Bununla birlikte enzimler hassas yapıda makro-moleküllerdir. Reaksiyon sonunda tekrar kazanımlarını sağlamak ve stabilite iyileştirmeleri için immobilizasyon işlemi gereklidir. Bunun yanında immobilizasyon işlemi sonucu olarak katalitik aktivitenin yükselmesi de arzu edilen bir sonuçtur. İmmobilizasyon işleminin başarılı oldugunun önemli belirleyici faktörlerinden biri de enzimin tekrar kullanım kapasitesidir. Immobilize CALB 'nin ticari bir türevi olan Novozyme 435® ɛ-kaprolakton halka açılması polimerizsyonunda yüksek verimi ile bilinmektedir. Bununla birlikte, immobilizasyon taşıyıcı maddesinden kaynaklanan yüksek enzim maliyeti ve taşıyıcı ile enzim arasındaki bağın zayıflığından kaynaklanan enzim sızdırma durumları hala güncel problemlerdir. Bu sebeplerden ötürü, mevcut sistemlere alternatif olacak daha ucuz ve etkin immobilizasyon yaklaşımları literatürde yer almaktadır. Mevcut çalışmada, ticari ismi Lipozyme® olan serbest enzim pirinç kabuğu külü üzerine immobilize edilmiştir. Pirinç kabuğu tarımsal bir atık olarak kolay erişilebilinir ve ucuz bir materiyaldir. Aynı zamanda bu materiyal kontrollü sıcaklık ve sürede ısıl işlem gördüğünde amorf silika için bir kaynak olmaktadır. Amorf silikanın ince tanecik yapısı, gözenekli ve geniş yüzey alanı bu materiyali immobilizasyon çalışmaları için iyi bir taşıyıcı seçeneği yapmaktadır. Bu çalışmada, enzimin taşıyıcı uzerinden ayrılmasını en az seviyeye indirebilmek için CALB 'nin taşıyıcı üzerinde kovalent olarak bağlanılmasına çalışılmıştır. Yeni dizayn edilen immobilize enzimin performansı ɛ-kaprolakton'un halka açılma polimerizasyonu üzerinde değerlendirilmiştir. Pirinç kabukları 600 0C 'de altı saat yakılarak taşıyıcı materiyal elde edilmiştir. Isıl işlem ardından, pirinç kabuğu külünün yüzey modifikasyonu iki aşamada tamamlanmıştır. Öncelikle, taşıyıcı yüzeyinde 3-aminopropiltrimetoksisilan (3-APTMS) ile silanlama işlemi gerçekleştirilerek fonksiyonel amino grupları elde edilmiştir. Ikinci aşamada, gluteraldehit kullanılarak taşıyıcı yüzeyi aktifleştirilmiştir. Immobilizasyon parametreleri arasında en iyi koşulları belirleyebilmek için farklı 3-APTMS ve gluteraldehit konsantrasyonları ile beraber farklı enzim yükleme oranları da parametrik çalışmalar süresince değerlendirilmiştir. Bu çalışmalara ilave olarak, depolama stabilitesi, optimum sıcaklık ve pH etkileri de incelenmiştir. Immobilizasyon çalışmaları süresince pirinç kabuğu külü, yüzey modifikasyonlu kül ve immobilize enzim karakterizasyonu için fourier dünüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR), termal gravimetrik analiz (TGA) ve tarayıcı elektron mikroskopisi (SEM) kullanılmıştır. Mevcut çalışmanın ikinci aşamasında, çapraz bağ metodu ile pirinç kabuğu külü yüzeyinde immobilize edilen enzimin performansı polykaprolakton sentezi üzerinde değerlendirilmiştir. En iyi reaksiyon parametrelerinin belirlenmesi için ɛ-kaprolakton polimerizasyon reaksiyonları farklı süreçlerde (6, 24, 48, 72 ve 120 saat) ve farklı sıcaklıklarda (30, 40, 60 ve 80 0C) uygulanmıştır. Ayrıca Enzim konsantrasyonunun polimerizasyon üzerindeki etkisi farklı enzim : monomer konsantrasyonlarında incelenmiştir. Polimerizasyon işlemi Lipozyme® ve Novozyme 435 ile belirlenen reaksiyon parametrelerinde uygulanarak elde edilen sonuçlar yeni enzimin sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Çalışma boyunca en iyi reaksiyon koşullarında elde edilen ürünlerin moleküler ağırlık dağılımları ve yapısal tanımlamaları jel permeasyon kromatografisi (GPC) ve FT-IR spektroskopisi kullanılarak analiz edilmiştir. Polimer örneklerinin kristal yapıları Proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (1H-NMR) ve X-ışını kırılması (XRD) aracılığı ile tayin edilmiştir. Ayrıca, polimer örneklerinin termal analizleri TGA ve differansiyel tarama kalorimetresi aracılığı ile elde edilmiştir. Polimer ürünlerinin yüzey yapıları SEM aracılığı ile incelenmiştir. Bu çalışma boyunca elde edilen sonuçlara göre ppirinç kabuğu külü yüzeyinde yapılan modifikasyonlar ve enzim immobilizasyonu FT-IR ve TGA anazlileri aracılığı ile doğrulanmıştır. Serbest enzyme kıyasla, immobilize enzim %73,1 relatif aktivite ve %98 protein yükleme verimliliği göstermiştir. Spesifik aktivite serbet enzyme göre %74 oranında korunmuştur. Depolama stabilite çalışmalarının ( 3 ay) sonucunda, immobilize enzim aktivitesinin %67'sini korunduğu gözlemlenmiştir. Termostabilite çalışmaları kapsamında elde edilen sonuçlara göre, enzim relative aktivitesinde 80 0C 'ye kadar düşüş gözlemlenmemesi enzimin termofilik özellik kazandığını işaret etmektedir. En iyi reaksiyon koşullarında elde edilmiş polimer zincirlerinin karakterizasyonu FT-IR ve 1H-NMR analizleri ile doğrulanmıştır. GPC analiz sonuçlarına göre 60 0C ve 24 saat polimerizasyon süreci sonunda elde edilen ürünlerin moleküler kütlesi 13700 g/mol olarak kaydedilmiştir. Polidispersite indeksi (PDI) ve monomer çevirimi sırwası ile 1,5 PDI ve %92 olarak saptanmıştır. Bu sonuçlara göre yeni tasarlanan immobilize enzim serbest enzime göre daha yüksek stabilite değerlerine ulaşmıştır.
Özet (Çeviri)
The Employment of enzymatic catalyss in polymer sytheses have attracted attention, thanks to provides control on stereochemistry, chemoselectivity, and regioselectivity. Unlike organic synthesis, enzymatic polymerization provides yielding non-toxic, biocompatible and biedegradable products. Through these advantages, the products obtained by enzymatic polymerization find widely usage in medical applications such as biomedical engineering, drug release systems and tissue and organ transplantations. As another significant point, some of polymetic products, such as cellulose, chitin, xylan and hyaluronan, are only able to be obtained succesfully by enzymatic polymerization. Poly(ε-caprolactone) (PCL) is a focus of interest because of its advantages over other biopolymers with regards to mainly favorable degradation rate and controllable pore size. Its crystallinity is able to reach up to 69%, depending on the molecular weight in the manner that as the moleculer weight decreases, the crystallinity increases. Thus, its mechanical and thermal properties as well as physical structure are govern mainly by the moleculer weight, varying between 530 and 630 000 g/mol. Other significant propety of PCL is to owning good miscibility with various polymers such as poly (lactic acid), poly(vinyl chloride), poly(bisphenol-A) and poly(styrene–acrylonitrile). PCL is more relatively stable in ambient conditions, highly biocompatible, easy to manufacture, and viable in various type of scaffold. Therefore, inherent properties of PCL reveal themself on the area of tissue engineering. Among various lipases from differient origins, it is observed that Candida antartica lipase B (CALB) showed relatively high catalyhtic activity for the polymerization of ɛ-caprolactone (ɛ-CL) to PCL. Enzymatic synthesis of PCL may be categorized two main pathway, which are polycondensation reaction, and ring opening polymerisation (ROP). As to polycondensation polymerization, beside the necessity of additional process to removal by-products (water), low molecular weight is a drawback on polycondensation reactions. Because of these drawbacks related to polycondensation reaction, ROP of ε-caprolactone came into prominence in PCL synthesis. Nevertheless, enzymes are frigle macromolecules, which need to be immobilized in order to gain stability and to be recovered at the end of the reaction. Besides, it is a desired result of the immobilization process to improve cataltic activity of the enzymes. The reuse capability of immobilized enzymes is an significant determinative factor on immonilization achievement. The commercially derivative of immobilized CALB, Novozyme 435® , is known with its high efficiency on ROP of ɛ-caprolactone (ɛ-CL). However, the high cost of this enzyme, because of the immobilization support material, and enzyme leakage issue are still general concerns. For these reasons, more effective and cheaper immobilization approaches on CALB, which can be alternative to available systems, is a current trend in the literature. In the present study, free CALB, commercially named as Lipozyme® , was immobilized onto rice husk ash (RHA). Rice husk (RH), as agricaltural waste, is an easy accessible and cheap material, which is a possible source for production of amorphous silica when it is treated thermally in controlled temperature and time. The fact that amorphous silica, with very fine particles, has large surface area and porous structure, makes it an attractive choice of carrier for immobilization studies. In this study, cross-linking method was applied by bonding of CALB to the support via a spacer molecule covalently in order to overcome enzyme leakage issue. The performance of the new enzyme preparate, obtained through this process, was evaluated in ROP of ɛ-CL. In order to obtain support material, RH was burned at 600 0C for 6 hours. After thermal treatment, surface modification on the RHA was accomplished in two step. Firstly, the surface was silanized with 3-aminopropyltrimethoxysilane (3-APTMS) to obtain the functional amino groups. In second step, glutaraldehyde was used as cross-linking agent to activate amino-functionalized surface. In order to determinate the best conditions in immobilization parameters, different 3-APTMS and glutaraldehyde concentrations as well as enzyme loading ratios were evaluated during parametric studies. In addition, storage stability, optimum temperature and pH were investigated. Throughout the immobilization study, fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), thermal gravimetric analysis (TGA), and scanning electron microscopy (SEM) were performed in order to characterize RHA, surface-modified RHA, and the new immobilized lipase. In the second phase of this study, performance of immobilized CALB on surface modified RHA by cross-linking metod was evaluated in PCL sythesis. Polymerization reactions of ɛ-CL were conducted in at various periods (6, 24, 48, 72, and 120 hours) and at different temperatures (30, 40, 60, and 80 ֩ C) in order to determinate the best reaction conditions. Besides effects of the enzyme concentration in the polymerization was examinated at different enzyme : monomer ratios. Polymerization reactions were performed with Lipozyme® and Novozyme 435 in optimum reaction conditions conditions in order to compare the results with that of new immobilized enzyme. Molecular weight distributions and structural identification of products were carried out by means of gel permeation chromatography (GPC) and FT-IR spectroscopy. Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) and X-ray diffraction (XRD) studies were performed in order to reveal crystal structures of the polymer samples. Besides, Thermal analysis of samples was done by TGA and differential scanning calorimetry (DSC) analysis. Structural details of the surface of polymer were characterized by means of SEM. As to the results, obtained throughout the current study, surface modified RHA and enzyme immobilized surface of the support were confirmed by FT-IR and TGA analyses. In comparison with free enzyme, immobilized enzyme remained 73.1 % of relative activity with 98 % protein loading efficiency. The specific activity was recorded as %74 of that of free enzyme. After 3 mounths of storage stability evaluation, the immobilized enzyme retained 67 % of its activity. According to the results, recorded during immobilized enzyme studies, it is indicating enhanced thermal stability that there was not a noticeable decrease in relative activity up to 80 0C for immobilized enzyme. Characterization of polymer chains of product, obtained in enzymatic ROP of ɛ-CL in pre-determinated best reaction conditions, were evaluated and verified by FT-IR and 1H-NMR analyses. According to GPC results of products, yielded by crosslinked lipase, the highest molecular weight was obtained as 13700 g/mol at 60 0C and 24 hours reaction period with 1,5 polydispersity index (PDI) and %92 monomer conversation. These results are promising an energy-saving and eco-friendly enzymatic PCL process with monodispersed products and better stability than that of free enzyme.
Benzer Tezler
- Controlled delivery of chalcone via biopolyester nanohybrid
Biyopoliester nanohibrit ile kalkonun kontrollü salımı
YASEMİN KAPTAN
Doktora
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR
- Effect of silanization agent on the development of nanohybrid systems
Nanohibrit sistemlerinin geliştirilmesinde silanlama ajanının etkisi
MELTEM AKKULAK
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR
- Effect of silanization agent on the immobilization of lipase on a silica-based support material
Silika bazlı taşıyıcıya lipaz immobilizasyonunda silanlama ajanının etkisi
YASEMİN KAPTAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR
- Immobilization of lipase on an inorganic support material and polycaprolactone synthesis
Lipazın inorganik taşıyıcıda immobilizasyonu ve polikaprolakton sentezi
CANSU ÜLKER
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR
- Drug loading of G-PCL/RHA nanohybrid system and pH effect on drug release
G-PCL/RHA nanohibrit sistemine ilaç yüklenmesi ve ilaç salımına pH etkisi
ÇAĞLA MENTEŞOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATOŞ YÜKSEL GÜVENİLİR