Farede spermatogenez boyunca metilasyon imprintlerinin meydana getirilmesinde Boris geninin rolü
The role of the Boris gene in generation of methylation imprints during mouse spermatogenesis
- Tez No: 294309
- Danışmanlar: DR. JAMES MCGRATH, PROF. DR. RAMAZAN DEMIR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Histoloji ve Embriyoloji, Genetics, Histology and Embryology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 150
Özet
BORIS (Brother of the Regulator of Imprinted Sites; CTCFL), genetik olarak imprinte genlerin ekspresyonuna katılan bir proteindir. Ekspresyonu, erişkin vücudunda normal koşullar altında sadece testiste, bunun dışında malignant hücrelerde ve kök hücrelerde belirlenebilmiştir. Genlerin doğru bir şekilde ekspre olmasının, fertilizasyon ve sonrasında fetüsün gelişimi için ne kadar önemli olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, çalışmamızda, genetik mühendisliği teknikleriyle Boris gen ekspresyonunun değiştirildiği transgenik fareler kullanıldı. Boris'in normal spermatogenez, erkek fertilitesi (in vivo ve in vitro olarak) ve fetal büyüme ve yaşayabilirlik üzerindeki etkileri araştırılarak, Boris'in H19/Igf2 bölgesi gibi önemli bir imprinting lokusunda doğru metilasyon imprintlerinin oluşmasındaki olası rolü ortaya konuldu.Fare Boris geni mutant ve normal olmak üzere iki farklı formda, GFP (yeşil fluoresan protein) ve tetrasiklin (Tet) duyarlı element içeren iki yönlü Tet plasmidine (pTRE-Tight-Bl-AcGFP1) klonlandı. Bu sistem Boris transgeni ekspresyonunun sadece testiste ve tetrasiklin analoğu olan doksisiklin varlığında görülebilmesine imkan sağladı. Elde edilen plasmid, fare zigotlarına enjekte edildi. Genotipleme ile tespit edilen kurucu (ata) Boris transgenik fareler, testise özgü ekspresyon için testis-spesifik promoterlerin bulunduğu Protamin Cre veya Snaptonemal kompleks Cre transgenik fare soyları ve indüksiyon için tetrasiklin-kontrollü transaktivatör protein (rtTA)'e sahip rtTA transgenik fare soyları ile çiftleştirildi. Doksisiklin (2mg/ml) muamelesine tabi tutulan farelerin testislerinden RNA izolasyonu yapılarak kantitatif gerçek zamanlı PCR metodu uygulandı. Testis örnekleri ışık ve fluoresan mikroskopla incelendi. Proliferasyon indeksleri (PCNA) ve apoptotik hücre oranları hesaplandı. Bu fareler ile çiftleştirilen dişi farelerin gebelikleri doğuma kadar takip edilerek yavrulardaki embriyonik hasarlar değerlendirildi. Bisülfit sekanslama analizleri yapılarak H19 DMD metilasyonu araştırıldı.Çalışmamızın sonuçları, Boris transgenik fare soylarının fertil olduğunu ancak Boris proteini ve spermatogenez arasında potansiyel bir ilişki olabileceğini işaret etmektedir. Doksisiklin ile muamele edilmiş mutant ve normal Boris transgenik fare yavruları, kontrol gruplarına göre daha düşük vücut ağırlığına sahip iken yüksek postnatal mortalite oranı göstermiştir. Etkilenen yavruların birçok organ yapısında büyüme geriliği tespit edilmiştir. Ayrıca yetişkin ve yavru Boris transgenik fare DNA'sında H19 DMD metilasyonu kontrollere göre farklı bulunmuştur.Çalışmamız, Boris geni ile embriyogenez ve fetal gelişim bozuklukları arasındaki ilşkiyi ortaya koyan literatürdeki ilk çalışmadır. Gelecek çalışmalarımız, embriyogenez boyunca Boris geninin anormal ekspresyonunun nasıl olup da normal gelişimi değiştirebildiğine dair olası mekanizmalar üzerinde yoğunlaşacaktır.
Özet (Çeviri)
Brother of the Regulator of Imprinted Sites (BORIS; CTCFL) is a gene that has been implicated in the expression of genetically imprinted genes. In adult animals, it is normally expressed in the testes and is reactivated and expressed in many cancer cells and embryonic stem cells. However, it is well known that the appropriate gene expression is crucial for the fertilization and further fetal development. Therefore, we genetically engineered mice in such a way to allow expression of the Boris gene to determine its effects on spermatogenesis, male fertility (both in vivo and in vitro), fetal growth and viability and also the formation of methylation imprints in H19/Igf2 locus.The mouse Boris gene, two different forms as mutant and normal, was cloned into the Bidirectional Tet plasmid (pTRE-Tight-Bl-AcGFP1) that contains GFP and a tetracycline (Tet) responsive element which permits expression of the Boris transgene when doxycycline is present in the drinking water. This plasmid was injected into mouse zygotes to create the transgenic strains. Mice born from injected zygotes were screened by PCR to determine founder lines. These mice were then bred to transgenic strains that carry testis specific promoters, Protamine Cre or Synaptonemal complex Cre, and tetracycline controlled transactivator protein (rtTA) for the ectopic gene induction. The triple transgenic mice were then administered of a 2-3 month course of doxycycline (2mg/ml supplemented with %5 sucrose) in drinking water. RNA samples were extracted from testis and quantitative real time PCR method (qRT-PCR) was performed. Testis samples were further evaluated by light and fluorescein microscopy and proliferative index (PCNA) and percentage of apoptotic cells were calculated. Females bred to such males and who were on doxycycline during the pregnancy were allowed to give birth and altered embryonic defects in the offspring were analyzed. Bisulfite sequencing was performed to analyze H19 DMD methylation status.Our results showed that both Boris transgenic mice were fertile but there was a potential relation between Boris and spermatogenesis. The offspring from doxycycline fed mutant and normal Boris transgenic mice were smaller with a higher postnatal mortality rate compared to that of control mice. The affected pups, confirmed by genotyping, showed retarded growth in most organs. In addition, H19 DMD methylation status was found to be significantly different than controls with the adult and offspring DNA samples.Our study is of importance for being the first to investigate the possible relationship between BORIS and embryogenesis defects and fetal development. Future work will focus on possible mechanisms for how the Boris gene, when aberrantly expressed during embryogenesis could alter normal development.
Benzer Tezler
- Nikotin ile oksidatif strese maruz bırakılan farelerde curcuminin testis üzerine etkileri
Effects of curcumine to the nicotine induced oxidative stress in mice testis
GÜLFİDAN COŞKUN
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
Histoloji ve EmbriyolojiÇukurova ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. HÜLYA ÖZGÜR
- Kronik miyeloid lösemi tedavi dozundaki Nilotinib'in folikülogenez ve spermatogenez üzerindeki etkisinin sağlıklı fare modelinde gösterilmesi
The effect of CML treatment doses ni̇loti̇ni̇b on spermatogenesis and folliculogenesis in a healty mouse model
GÜLDANE CENGİZ SEVAL
Tıpta Yan Dal Uzmanlık
Türkçe
2014
HematolojiUfuk Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MELTEM AYLI
- Fetal, neonatal, puberte ve erişkin fare testisinde PARP-1, PARP-2 VE PAR ekspresyonlarının araştırılması
Başlık çevirisi yok
NAZLI ECE GÜNGÖR
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
Histoloji ve EmbriyolojiAkdeniz ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ÇİLER ÇELİK-ÖZENCİ
- Farede sentetik bitki büyüme hormonlarının biyolojik teratojenik ve kalıtsal etkilerinin araştırılması
Başlık çevirisi yok
H. RAMAZAN YILMAZ