Geri Dön

Hayvansal hücre/hücresel ürün üretimi için sıcaklık duyarlı mikrotaşıyıcıların sentezi ve karakterizasyonu

Synthesis and characterization of thermoresponsive microcarriers for the production of animal cells/cellular products

  1. Tez No: 299547
  2. Yazar: HEDİYE ÖZGEN TİMUÇİN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Mikrotaşıyıcı-destekli kültür, atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP), biyoreaktör, hücre kültürü, sıcaklık-duyarlı polimer, Microcarrier-supported culture, atom transfer radical polymerization (ATRP), bioreactor, cell culture, thermo-responsive polymer
  7. Yıl: 2011
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 119

Özet

Mikrotaşıyıcı-destekli kültürler, memeli hücreleri kullanarak viral aşılar ve biyolojik hücresel ürünlerin üretimi amacıyla van Wezel tarafından geliştirilmiştir. Polimerik mikrotaşıyıcılar süspanse ortam koşullarında geniş yüzey alanı sağlayarak hücrelerin büyük miktarlarda üretimine olanak verirler. Çeşitli biyolojik ürünlerin analitik ve endüstriyel boyutta üretimi için geliştirilmiş çok sayıda ticari mikrotaşıyıcı mevcuttur. Mikrotaşıyıcıların doku mühendisliğindeki kullanımı ise sınırlıdır. En yaygın olarak kullanılan mikrotaşıyıcılar dekstran-temelli matrisler (Cytodex®) olup, kıkırdak ve kemikden türetilmiş hücreler de dahil olmak üzere çok sayıda hücrenin yapışma ve üremesini desteklemektedirler. Doygunluğa ulaşmış hücreler mikrotaşıyıcı yüzeyinden proteolitik enzimlerin, örneğin tripsin, yardımıyla kaldırılırlar. Ancak tripsin kullanımı çok sayıda dezavantajı beraberinde getirmektedir.Çevre sıcaklığındaki değişimlere karşı hacimsel geçişlerle cevap veren sıcaklık-duyarlı hidrojellerin hücre kültürlerinde hücre-destek malzemesi olarak kullanımları giderek artan bir ilgiye maruz kalmaktadır. Sıcaklık-duyarlı polimerlerde, hücre kültürü sıcaklığındaki değişimlerle hücrelerin yüzeye yapışma davranışlarının incelendiği çok sayıda çalışma mevcuttur. Sıcaklık-kontrollu hücre yapışma/kaldırma çalışmalarında en çok kullanılan polimer poli(N-izopropil akrilamid) (PNIPAAm)'dır. PNIPAAm yüzeye 37oC'de yapışıp üreyen hücreler sıcaklığın PNIPAAm'in ?en düşük kritik çözünme sıcaklığı?nın (LCST=32oC) altına düşürülmesiyle, tripsin veya EDTA kullanımına gerek olmaksızın yüzeyden kendiliğinden kaldırılırlar. PNIPAAm-aşılanmış doku kültür kapları (TCPS), hücre-hücre etkileşimlerini ve ekstrasellüler matris etkileşimlerini ortadan kaldırmadan hücrelerin tabaka halinde yüzeyden kaldırılmasına olanak verir. Sıcaklık-duyarlı polimerleri TCPS yüzeyine kaplamak için çok çeşitli yöntemler mevcuttur. Örneğin, elektron demeti polimerizasyonu, kovalent bağlama, plazma yük boşalımı, UV-ışını radyasyonu gibi. Tüm bu yöntemler hücre-tabaka mühendisliği uygulamaları için TCPS yüzeylere uygulanmıştır. Ancak, şu ana kadar hücre ve hücresel ürünlerin büyük ölçekte üretimine yönelik sıcaklık-duyarlı bir mikrotaşıyıcı geliştirilmemiştir.Yapılan çalışmanın ilk kısmında, yüzeye-bağımlı karakterdeki hayvansal hücrelerin kayma kuvvetlerinin etkisinden korunarak büyük-ölçekli reaktörlerde üretimine ve proteolitik enzim ve şelasyon ajanı kullanılmaksızın yüzeyden kaldırılmalarına olanak sağlamak amacıyla üç tür mikrotaşıyıcı (PNIPAAm-g-PHEMA, PNIPAAm-g-PVA, PNIPAAm-g-dekstran) sentezlenmiştir. Mikrotaşıyıcı sentezi biyouyumluluğu yüksek dekstran doğal polimeri ile poli (hidroksietilmetakrilat) (PHEMA) ve poli(vinilasetat-hidroksi) (PVA) sentetik polimerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sıcaklık-duyarlılık özelliği, atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP) yöntemi kullanılarak, poli(N-izopropilakrilamid) (PNIPAAm) ile sağlanmıştır. Sentezlenen mikrotaşıyıcılar, ATR-FTIR, XPS (ESCA), AFM, SEM ve şişme deneyleriyle karakterize edilmiştir.Çalışmanın ikinci kısmında, sentezlenen mikrotaşıyıcıların hayvansal hücre kültürlerinde kullanılabilirliklerinin belirlenmesi ve optimum özellikleri sağlayan mikrotaşıyıcı seçiminin yapılması amacıyla sentezlenen mikrotaşıyıcılar ile hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir. İlk olarak statik kültür ortamlarında çalışılmış, ardından karıştırmalı reaktör kullanılarak dinamik kültür koşulları sağlanmıştır. Statik kültür çalışmaları sonunda PNIPAAm-g-PHEMA mikrotaşıyıcılar dışındaki mikrotaşıyıcıların hücre yapışması ve üremesini istenilen düzeyde desteklemediği belirlenmiştir. Bu nedenle dinamik kültür çalışmaları yalnızca PNIPAAm-g-PHEMA mikrotaşıyıcılar ile yürütülmüştür. Hücre kültür çalışmalarında farklı morfolojiye sahip 2 tür hücre hattı (L929 fare fibroblast hücreleri ve HS2 insan keratinositleri) kullanılarak, mikrotaşıyıcılara yapışma ve yüzeyden kopma açısından hücre morfolojisinin etkisi karşılaştırılmıştır.Yapılan hücre kültürü çalışmalarının sonucunda, sentezlenen mikrotaşıyıcılardan PNIPAAm-g-PHEMA mikrotaşıyıcıların özellikle dinamik koşullarda hücre üretimi için uygun olduğu ve sıcaklık-duyarlık etkisi ile hücrelerin yüzeyden geri kazanımında kullanılabilecekleri sonucuna varılmıştır. Ayrıca hücre morfolojisinin de üretimi etkileyeceği tespit edilmiştir. Böylelikle gerek doku mühendisliği uygulamaları için yüksek sayıda hücre üretmek, gerekse yüksek kapasitede hücresel ürün üretimini kolaylıkla ve etkin bir biçimde gerçekleştirmek mümkün olacaktır.

Özet (Çeviri)

Microcarrier-facilitated cell cultures was introduced by van Wezel to mass produce viral vaccines and biological cell products using mammalian cells. Polymeric microcarriers offer the advantage of providing a large surface area for monolayer cell growth during propagation in a homogenous suspension culture system. A wide range of commercially available microcarriers has been successfully used for the production of a variety of biological products at the analytical and industrial scales. The use of microcarriers in tissue engineering has only been explored to a limited extent. The most commonly used microcarriers are composed of a dextran matrix (Cytodex®), which facilitates attachment and proliferation of a wide-range of cells, including those derived from cartilage and bone. Cells reached to confluency have been detached from the surface of microcarriers by use of proteolitic enzymes, usually trypsin. However, use of trypsin has a number of drawbacks on the viable cells.The temperature-sensitive hydrogels which display volume transitions in response to temperature changes in the environment are gaining much attention for their possible use in cell cultures as cell support materials. There are various studies reporting the control of cell-surface adhesion by exploiting cell culture temperature on thermoresponsive polymers. Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) is one of the most extensively used thermoresponsive polymer for temperature-controlled cell attachment/detachment. Cells adhered on PNIPAAm surfaces at 37 ? C were spontaneously lifted by reducing culture temperature below the lower critical solution temperature (LCST, ? 32 ? C) without any need for trypsin or EDTA. PNIPAAm-grafted tissue culture grade polystyrene dishes were used for the application of cell-sheet engineering in which the cells were harvested from the thermoresponsive surfaces without damaging the extracellular matrix proteins and cell-to-cell connections. A large range of different methods can be used to fabricate insoluble thermoresponsive surfaces, e.g. electron-beam polymerization, covalent attachment, plasma glow discharge, UV-light irradiation. All those methods had been applied for the polymerization of NIPAAm to TCPS (tissue culture polystyrene dish) for producing thermoresponsive surfaces for cell sheet engineering. However, no thermoresponsive microcarrier is available until now for the large-scale production of cells and cellular products.At the first part of the study conducted, three types of microcarriers (PNIPAAm-g-PHEMA, PNIPAAm-g-PVA, PNIPAAm-g-dextrane) were synthesized to enhance the production of animal cells having surface-adherent character in large scale reactors by preserving them from effects of shear forces and to enhance their removal from the surface without using proteolitic enzyme and chelating agent. Microcarrier synthesis is performed by using a highly biocompatible natural dextran polymer and two synthetic polymers, poly (hydroxyethlymethacrylate) (PHEMA) and poly (vinylacetate-hydroxy) (PVA). Thermosensitivity is obtained with poly(N-isopropylacrylamide) by using atom transfer radical polymerization (ATRP) method. The microcarriers synthesized are characterized by ATR-FTIR, XPS(ESCA), AFM, SEM and swelling experiments.In the second part of the study, cell culture studies were performed with the synthesized microcarriers. At first, the static culture environments were applied, and then using a stirred reactor dynamic culture conditions were provided. The static culture studies were shown that, microcarriers except PNIPAAm-g-PHEMA, were not support cell adhesion and growth in the desired level. For this reason, dynamic culture studies were carried out with only the PNIPAAm-g-PHEMA microcarriers. In cell culture studies, two types of cell lines with different morphology (L929 mouse fibroblast cells and human keratinocytes HS2) were used and adhesion characteristics and cell morphology in terms of the effect of the surface characteristics were compared.As a result of the cell culture studies it was concluded that, PNIPAAm-g-PHEMA microcarriers are suitable for the production of cells especially in dynamic conditions and their thermosensitivity enhance the recovery of cells from the surfaces. In addition, cell morphology was found to affect the cellular production. Thus, to produce a high number of cells for tissue engineering applications and cellular products in high production capacity will be able to perform easily and effectively by the use of PNIPAAm-g-PHEMA microcarriers.

Benzer Tezler

  1. Sıçanlarda çekal bağlama ve delme yöntemi ile oluşturulan deneysel sepsis modelinde CDP-kolinin karaciğer ve ince bağırsak hasarı üzerindeki koruyucu etkilerinin morfolojik açıdan araştırılması

    Morphological investigation of protective effects of CDP-choline on damage of the liver and small intestine in the experimental model of sepsis in rats induced by cecal ligation and puncture

    NECDET DENİZ TİHAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    AnatomiBursa Uludağ Üniversitesi

    Anatomi Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. İLKER MUSTAFA KAFA

  2. NWPF diskler içeren reaktörlerde üç boyutlu hücre üremesinin incelenmesi

    Investigation of three dimensional cell growth in reactors containing NWPF discs

    ESİN ASLANKARAOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1999

    Kimya MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU

  3. Nanofiber-desenli polimerik membranlar: Yüzey kimyası, topografisi ve hücresel etkileşimler

    Nanofiber-patterned polymeric membranes: Surface chemistry, topography and cellular interactions

    MURAT ŞİMŞEK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    BiyomühendislikHacettepe Üniversitesi

    Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU

  4. Farklı koşul ve sürelerde dondurarak saklamanın yağ grefti ve stromal vasküler fraksiyon (SVF) ürünlerinin hücresel sağ kalımları üzerinde etkilerinin araştırılması

    Investigation of the effects of storage in different conditions and times on cell survival of fat graft and stromal vascular fraction (SVF) products

    MUSTAFA ÖZTÜRK

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    Histoloji ve EmbriyolojiSüleyman Demirel Üniversitesi

    Plastik Cerrahi Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SELMAN HAKKI ALTUNTAŞ

  5. Brusella hastalarında NRF2, hemoksijenaz (HO1), neopterin seviyelerinin incelenmesi

    Examination of NRF2, hemoxygenase (HO1), neopterin levels in patients with brucella

    BÜŞRA ÖZTÜRK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyokimyaHarran Üniversitesi

    Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NİHAYET BAYRAKTAR