Functional and biochemical analysis of a novel deubiquitinating enzyme, USP32
Yeni bir deubikitinaz enzimi olan USP32 nin fonksiyonel ve biyokimyasal analizi
- Tez No: 313694
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. A. ELİF ERSON BENSAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Ubikuitin, deubikuitinasyon, DUBs, ubiquitin specific proteases, Ub zinciri, USP32, Ubiquitin, deubiquitylation, DUBs, ubiquitin specific proteases, Ub chains, USP32
- Yıl: 2012
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 115
Özet
Ubikuitinasyon hücre içerisinde önemli bir tranlasyon sonrası modifikasyondur ve deubikitinaz enzimleri (DUBs) tarafından geri çevirilebilir. Proteinlerin ubikuitinasyon ve deubikuitinasyonu hücre içerisinde proteinlerin yıkımı, sinyal iletimi, vesikül trafiği, DNA tamiri ve apoptoz gibi birçok hücresel olayın düzenlemesinde görev alır. USP32, ubiquitin specific proteaz 32, meme kanserinde sıklıkla amplikasyona uğrayan 17q23 kromozom bölgeside yer alan bir gendir. Çalışmamızda USP32'nin meme kanserindeki potansiyel rolünü anlayabilmek için USP32 proteininin deubikuitinaz aktivitesini karakterize etmek amaçlandı. Biyoinformatik analizler USP32'nin ubikitin spesifik proteaz enzim ailesinde yaygın olarak bulunan Sis ve His domainlerine sahip olduğunu öngördü. In vivo ve in vitro DUB aktivite deneyleri USP32'nin aktif bir deubikuitinaz enzimi olduğunu ortaya koydu. USP32'nin aktif bir DUB enzimi olduğu belirlendikten sonra substrat özgüllüğü ve kinetik özelliklerinin incelenmek için USP32 proteini sinek hücre kültüründe ifade edildi ve izole edildi. USP32'nin substrat özgüllüğünün ve hücre içerisindeki muhtemel rollerinin anlaşılabilmesi için birbirlerine linear ve 7 farklı lizin grubu ile bağlanmış diubikuitinler (K6, K11, K27, K29, K33, K48 and K63) kullanılarak diubikuitin deneyi yapıldı. Sonuçlar USP32'nin 7 farklı diukuitin'in hepsini tanıyıp kestiğini ve bununla birlikte K6, K11, K48 ve K63 daha yüksek verimlilikle kesebildiğini gösterdi. Kinetik parametreler, Km, kcat ve kcat / Km, tam uzunlukta proteinin katalitik domain proteinine göre potansiyel subsratına karşı daha düşük afinitesi olduğunu ve daha düşük katalitik reaksiyon verimine sahip olduğunu göstermiştir. Bu bulgular da USP32 nin üçüncül yapısının ve proteaz aktivitesi olmayan diğer domainlerinin önemine işaret etmektedir, Hücre içerisinde USP32 fonksiyonları ve meme tümörünün gelişimine nasıl katkıda bulunabileceğini anlamak için çalışmalar devam etmektedir.
Özet (Çeviri)
Ubiquitylation is an important post-translational modification and can be reversed by the action of deubiquitinating (DUB) enzymes. The ubiquitylation and deubiquitylation of target proteins are significant in terms of regulating cellular events such as protein degradation, signal transduction, vesicle trafficking, DNA repair and apoptosis. Chromosomal band 17q23 is frequently amplified in breast cancers and harbors a predicted ubiquitin specific protease gene, USP32 (ubiquitin specific protease 32). Given its potential role in breast cancer, we aimed to characterize USP32 for its potential DUB activity. Bioinformatic analysis of USP32 and known yeast and mouse DUBs suggested presence of Cys-His domains which are common in active DUBs of the USP superfamily. Our in vivo and in vitro DUB activity assays revealed that USP32 was indeed an active deubiquitinating enzyme. To investigate its substrate specificity and kinetic properties, USP32 was expressed in insect cell culture to be isolated and purified. Using isolated USP32 protein, diubiquitin assay was performed with all seven types of diubiquitin (K6, K11, K27, K29, K33, K48 and K63) as well as linear diubiquitin. Results showed that USP32 was able to cleave all seven types of ubiquitin linkages with higher cleavage efficiency for K6, K11, K48 and K63-linked diubiquitin. Moreover, kinetic parameters, Km, kcat and kcat/ Km, suggested that full length protein had lower affinity for potential substrates and lower catalytic activity compared to the catalytic domain alone. These data suggested the importance of USP32 tertiary structure and possible role of other non DUB domains (e.g. EF hand domain) which may be regulated by an as of unknown mechanism in cells. Further investigations are underway to understand the functions of USP32 in cells and how it may contribute to breast tumorigenesis.
Benzer Tezler
- Molecular analysis of cortical malformation in mammalian cortex by using proteomics approaches
Proteomik yaklaşımlar kullanılarak memeli korteksindeki kortikal malformasyonun moleküler analizi
BERFU NUR YİĞİT
Doktora
İngilizce
2024
GenetikKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURHAN ÖZLÜ SICAKKAN
- Disease gene identification using linkage and exome analyses
Bağlantı ve ekzom analizleri kullanarak hastalık geni keşfi
İLKER KARACAN
Doktora
İngilizce
2019
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI
- Lactobacillus reuteri E81'de kodlanan glukansükraz ve glukanotransferaz enzimlerinin biyokimyasal karakterizasyonu, bu enzimler ile özgün prebiyotikoligosakkaritlerin üretimi
Biochemical characterization of glucansucrase and glucanotransferase enzymes encoded in Lactobacillus reuteri E81, production of unique prebiotic oligosaccharides with these enzymes
HÜMEYRA İSPİRLİ
Doktora
Türkçe
2020
BiyoteknolojiYıldız Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. OSMAN SAĞDIÇ
DOÇ. DR. ENES DERTLİ
- Dental stem cell mediated bone tissue engineering using porcine model
Domuz modeli üzerinde diş kök hücresi kullanılarak kemik doku mühendisliği
GÖRKE GÜREL PEKÖZER
Doktora
İngilizce
2017
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATMA NEŞE KÖK
PROF. DR. GAMZE KÖSE
- Biochemical and functional characterization of circular RNAs differentially expressed in cisplatin-treated HeLa cells
Sisplatin ile muamele edilmiş HeLa hücrelerinde farklı ifade edilen halkasal RNA'ların biyokimyasal ve fonksiyonel karakterizasyonu
BİLGE YAYLAK
Doktora
İngilizce
2023
Biyolojiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BÜNYAMİN AKGÜL