Dental stem cell mediated bone tissue engineering using porcine model
Domuz modeli üzerinde diş kök hücresi kullanılarak kemik doku mühendisliği
- Tez No: 465405
- Danışmanlar: DOÇ. DR. FATMA NEŞE KÖK, PROF. DR. GAMZE KÖSE
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 130
Özet
Kemik kendi kendini tamir etme potansiyeline sahip olmasına rağmen genetik bozukluklar, travma, tümör ameliyatları sonucu oluşan kritik boyutlu kemik hasarları rekonstrüksiyon ameliyatları ile rehabilitasyonu gerektirir. Bu hasarların tedavisinde otojenik kemik greftleri altın standart olarak kabul edilir (Von Wilmowsky et al., 2010). Yine de donor bölge morbiditesi, grefte ulaşılabilirliğin limitli olması, şekilsel uyumsuzluk gibi sorunlar kemik hasarlarının otojenik kemik greftleriyle tamirini zorlaştırmaktadır (Marolt, 2015). Greftle ilgili bu sınırlamaları azaltmak ve kemik oluşumunu artıracak daha güvenli bir yol oluşturmak için doku mühendisliği yaklaşımları kullanılır. Doku mühendisliği, doku ve organ nakillerine olan ihtiyacın büyümesi sonucunda ortaya çıkan ve malzeme bilimi ve hücre biyolojisi bilgisini birleştirerek doku yerine geçen ve vücudun“yedek parçaları”nın geliştirilmesini sağlayan interdisipliner bir alandır. Kemik doku mühendisliğinin birincil amacı, kritik boyutlu kemik hasarları sonucunda bozulan kemiğin doğal iyileşme mekanizması için gerekli optimum koşulları sağlamaktır (Schlegel et al., 2006). Doku mühendisliği 3 önemli kısımdan oluşur: hücre, iskele ve biyokimyasal ipuçları. Kemik doku mühendisliği iskeleleri, greft yapılan bölgeye yeterli mekanik stabiliteyi sağlayan, osteokondüksiyon, osteoindüksiyon ve osteogenezisi destekleyen şekilde tasarlanır (Cypher & Grossman, 1996). Hücre göçü, farklılaşması, kemik büyümesi ve damarlanmasını destekleyen kemik doku mühendisliği iskeleleri doğal ya da sentetik polimerler, seramikler ve kompozitler gibi çeşitli biyomalzemeler kullanılarak oluşturulur (Nair & Laurencin, 2007a). Biyoaktif moleküller de eklenerek hücre tutunması, yeni kemik oluşumu ve anjiyogenez de desteklenir (Devescovi et al., 2008). Kemik doku mühendisliği yaklaşımlarında, kemik oluşturma potansiyeli olan hücreler doku iskelesi üzerinde çoğaltılarak iskelenin osteokondüksiyon özelliği ile birlikte hücre merkezli osteogenezis yaparlar (Kwan et al., 2007). Bu amaçla, kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler (MKH) sıklıkla kemik doku mühendisliğinde kullanılır (Li et al., 2015; Liao et al., 2014). Ancak, kemik iliği alımı sırasında hastada oluşan travma, kemik iliği kaynaklı hastalıklar gibi sebepler kök hücre çalışmalarını yetişkin kök hücrelerini barındıran alternatif kaynaklar ve invaziv olmayan yeni doku toplama yöntemleri arayışına yöneltmiştir. Son dönemde yapılan çalışmalar, dental dokularda da yetişkin kök hücrelerin olduğunu göstermiştir (Gronthos et al., 2000). İnsanda, üçüncü molar dişleri 6 yaş civarında organogeneze başlar ve 18 yaşına kadar tam olarak gelişemez. Bu durum, o yaşa kadar tam faklılaşmamış hücrelerin bu dokuda bulunduğunu gösterir. Bu yüzden diş jerm kök hücreleri, primitive kök hücrelerin izolasyonunda kullanabilecek kemik doku dahil olmak üzere birçok hedef dokuya farklılaşma potansiyeline sahip ektomezenkimal bir kaynaktır (d'Aquino et al., 2008). Bunun yanı sıra, dental dokulardan MKH izole etmek kolay, ucuz, güvenli ve etiktir. Bu kök hücreler MKH ile benzer yüzey antijeni profiline sahiptir (Calikoglu Koyuncu et al., 2014). Bir yüzey antijeni olan stromal öncül antijeni-1 (STRO-1), MKH'lerin kemik hücresi öncüllerini içeren ve fonksiyonel kemik hücrelerine dönüşebilen bir alt populasyonunda bulunur (Gronthos et al., 1994). Bu sebeple, STRO-1 yüzey antijeni bulunduran hücrelerin seçilmesi dental kök hücrelerin içerisinden osteojenik hücrelerin ayrılması için verimli bir strateji olduğu düşünülmektedir. Kalsiyum fosfat bazlı seramikler, osteokondüktif özellikleri ve mekanik özelliklerinin doğal kemik ile benzemesi sebebiyle kemik doku mühendisliğinde sıklıkla taşıyıcı madde olarak kullanılır (Dubok et al., 2010; Samavedi et al., 2013). Bir çok çalışmada hücreler, çeşitli seramik malzemeler ile önceden ex-vivo (Tsiridis et al., 2005) kültüre edilerek ya da operasyon sırasında hücreler ile kombine edilerek (Kokemueller et al., 2010) kullanılmıştır. Her iki yaklaşım da kendine özgü avantajlara sahip olmakla birlikte, kök hücrelerin alloplastik malzeme ile operasyon sırasında birleştirilerek kullanılması, kök hücre merkezli kemik iyileşmesinde daha kolay ve verimli bir prosedür olarak görülmektedir. Ancak, seramik bazlı malzemelerin hacim stabilitesinin azlığı ve işleme zorluğu gibi sebeplerden dolayı greftin uygulamasını kolaylaştıran ve hücrelerin yaşamasını destekleyen ek malzemelere ihtiyaç vardır (Spetzger et al., 2010). Biyobozunur ve biyoaktif polietilen glikol (PEG) bazlı hidrojel (MX10™, Straumann Holding AG, İsviçre), hücre ve proteinleri hasar bölgesine zarar vermeden ulaştıran yeni bir taşıyıcı malzeme olarak öne çıkmaktadır. Bu yüzden, hücreleri PEG hidrojele hapsederek seramik greft malzemesi ile birlikte uygulamak, kritik boyutlu kemik hasarlarının tedavisi için uygun bir strateji olarak düşünülmüştür. Bu çalışmada, evcil domuz, insana olan anatomik, fizyolojik ve metabolik benzerliklerinin yanı sıra diş yapısının benzerliğinden ötürü deneysel model olarak seçilmiştir. Domuz diş jermi kök hücreleri (dDJKH), 6 aylık domuzların üçüncü molar dişlerinden izole edilerek yüzey antijen profili bakımından karakterize edilmiştir. dDJKH'leri, STRO-1 yüzey belirtecini ifade etmeleri bakımından STRO-1(+) ve STRO-1(-) olarak ayrılmıştır. Tezin ilk kısmında, hücrelerin STRO-1 yüzey antijeni bulundurmalarına göre ayrılmalarının, hücre çoğalması ve osteojenik kapasite üzerine etkisi in vitro olarak araştırılmıştır. Bu amaçla STRO-1(+), STRO-1(-) ve ayırma işlemine tabi tutulmamış heterojen populasyon (US) arasında kıyaslama yapılmıştır. STRO-1(+) hücreler daha iyi çoğalma ve koloni oluşturma özellikleri göstermiştir. Tüm gruplar osteojenik farklılaşma göstermiş olup bu durum alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi, kalsiyum depolama testi, osteojenik mRNA ve proteinlerin tespiti ve mineralizasyon boyamaları ile gösterilmiştir. Farklılaşma testlerine göre STRO-1(+) hücreler, STRO-1(-) ve US hücrelere kıyasla in vitro ortamda osteogenez açısından daha iyi bir performans göstermemiştir. Bu sonuçlar, STRO-1(+) hücrelerin osteogenez açısından sahip olduğu iddia edilen özellikleri göstermesi için STRO-1(-) hücrelerin de içinde bulunduğu heterojen populasyona ihtiyaç duyduğunu göstermektedir. Tezin ikinci kısmında, STRO-1(+) ve US hücrelerinin in vivo osteogenez kapasitelerinin karşılaştırılmasının yanı sıra seramik ve hidrojel doku iskelelerinin kritik boyutlu kalvaryal kemik hasarlarının iyileşmesine etkisi araştırılmıştır. MX10 hidrojel, hücrelerin hasar bölgesine taşınması ve bu bölgede tutulması için uygun bir taşıyıcı iskele olarak bulunmuştur. Hücrelerin transplantasyon sonrası in vivo ortamda izlenmesi için kullanılan CM-DiI'in kullanışlı olduğu görülmüştür.
Özet (Çeviri)
Although bone has the potential to heal itself, genetic malformations, trauma and tumor surgery result in critical size defects in bone that need to be rehabilitated with clinical reconstruction procedures. The use of autogenous bone for the treatment of such defects is considered to be a golden standard (Von Wilmowsky et al., 2010). However, disadvantages, such as donor site morbidity, limited graft availability and morphological mismatch, make the reconstruction of these defects with autogenous bone challenging (Marolt, 2015). To eliminate the limitations of grafting and to establish a safer enhancement of bone formation, tissue-engineering approaches are employed. Tissue engineering is an interdisciplinary field that emerged as a result of the growing need for tissues and organs for transplantation and combines the knowledge of materials and cell biology for the development of tissue substitutes that act as“spare-parts”for the body. The primary goal of a bone tissue engineering scaffold is to provide an optimal environment for the natural healing mechanism of bone that is disrupted in critical-size defects (Schlegel et al., 2006). Tissue engineering includes 3 important parts: cells, scaffolds and biochemical cues. Bone scaffolds must be engineered to provide sufficient mechanical stability to the grafted area and support osteoconduction, osteoinduction and osteogenesis (Cypher & Grossman, 1996). Various biomaterials, such as natural or synthetic polymers, ceramics and composites, were used as tissue-engineering scaffolds to promote cell migration and differentiation, bone ingrowth and vascularization (Nair & Laurencin, 2007a). Also, bioactive molecules were added to enhance cell attachment, new bone formation and angiogenesis (Devescovi et al., 2008). In bone tissue engineering approach, cells with osteogenic potential are used to populate the scaffold for cell-mediated osteogenesis in combination with the osteoconductive effect of the scaffold (Kwan et al., 2007). For this purpose, mesenchymal stem cells (MSCs) derived from the bone marrow stroma have been used extensively in bone tissue engineering (Li et al., 2015; Liao et al., 2014). However, due to the complications related to bone marrow, such as surgical trauma caused by bone marrow harvesting procedures or bone marrow-related diseases, scientists focused on finding alternative resources of adult stem cells that require non-invasive or minimally invasive collection procedures. Recent studies have revealed the presence of adult stem cells in tissues of dental origin (Gronthos et al., 2000). In humans, third molars undergo organogenesis at around age 6 and do not completely develop until age 18. This means that undifferentiated cells remain in this tissue. Thus, tooth germ derived stem cells (TGSCs) are considered to be an ecto-mesenchymal source for isolating primitive stem cells that could differentiate into multiple lineages, including the osteogenic lineage (d'Aquino et al., 2008). Besides, the isolation of MSCs from dental tissue is easy, cost effective and does not raise additional safety and ethical concerns since they are obtained during regular orthodontic procedures. Stem cells of dental origin exhibit similar surface antigen profile with MSCs from other sources (Calikoglu Koyuncu et al., 2014). Stromal precursor antigen-1 (STRO-1), a surface antigen, is another surface antigen that is present only in a subpopulation of MSCs which are capable of differentiation into functional osteoblasts and include osteoprogenitors (Gronthos et al., 1994). Thus, selection of cells expressing STRO-1was thought to be an effective strategy to purify osteogenic cells from dental stem cells. Calcium phosphate based ceramics are frequently used as carrier materials in bone tissue engineering due to their osteoconductive properties and mechanical similarities with natural bone (Dubok et al., 2010; Samavedi et al., 2013). Various studies have utilized different ceramic materials either cultured with cells ex-vivo (Tsiridis et al., 2005) or combined with cells at the time of the surgery (Kokemueller et al., 2010). Although both approaches have different advantages in the clinical setting, the delivery of stem cells simultaneously with the alloplastic material during surgery seems to be an easier and feasible procedure to establish stem cell mediated bone healing. However, due to the poor volume stability and difficulty in handling the ceramic-based alloplasts (Spetzger et al., 2010), there is a need for additional materials that would facilitate the application of the graft while enhancing the survival and recruitment of stem cells. A biodegradable and bioactive polyethylene glycol (PEG) based hydrogel (MX10™, Straumann Holding AG, Switzerland) was introduced as novel carrier material that would have the ability to deliver proteins and cells at the defect site without damaging them. Thus, the delivery of stem cells using the PEG hydrogel and applying them in combination with a ceramic-based graft material might be an effective approach to promote osteogenesis in critical size bone defects. In this study, the domestic pig was used as an experimental model due to its anatomical, physiological, and metabolical similarities with humans as well as similar dentition to that of humans. Porcine TGSCs (pTGSCs) were isolated from mandibular third molar tooth germs of 6-month-old domestic pigs and characterized for their surface antigen profile. pTGSCs were sorted according to their STRO-1 expression as STRO-1(+) and STRO-1(-). In the first part of the thesis, in vitro proliferation and osteogenic differentiation capabilities of sorted cells were compared with each other to see the effects of STRO-1 sorting on their osteogenic capacities. STRO-1(+) cells exhibited a higher proliferation rate owing to their clonogenic properties. All three groups of cells were found differentiated into osteogenic lineage as shown by ALP activity, calcium deposition assay, detection of osteogenic mRNAs and proteins, and mineralization staining. According to differentiation analysis, STRO-1(+) cells did not show a better in vitro performance for osteogenesis compared to STRO-1(-) and US cells. In vitro results indicated that STRO-1(+) cells might require a heterogeneous population of cells including STRO-1(-) in their niche to perform their proposed role in osteogenesis. In the second part of the thesis, the osteogenic efficacy of transplanted allogenic pTGSCs in combination with ceramic and hydrogel based carrier systems on the healing of critical size defects in the pig calvaria was evaluated in vivo. MX10 hydrogel was found as an effective carrier for delivering stem cells and keeping them in the defect site. CM-DiI staining was useful for in vivo tracking of cells post transplantation.
Benzer Tezler
- Investigation of pluripotent stem cells in human dental follicle
İnsan dental folikülündeki pluripotent kök hücrelerin araştırılması
MEHMET EMİR YALVAÇ
Yüksek Lisans
İngilizce
2008
Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GAMZE TORUN KÖSE
YRD. DOÇ. DR. FATMA NEŞE KÖK
- Diş pulpasi mezenkimal kök hücrelerin yaş gruplarına bağlı karakterizasyonu
Dental pulp mesenchymal stem cells characterization based on age groups
EGEMEN KAYA
- Dental folikül mezenkimal kök hücrelerin pemphigus vulgarisli hastaların dendritik hücre ve lenfositleri üzerindeki immünregülatör etkilerinin araştırılması
Investigation of immunoregulatory effects of dental follicle mesenchymal stem cells on dendritic cells and lymphocytes of patients with pemphigus vulgaris
YAZGÜL KARATAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Allerji ve İmmünolojiMarmara ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Eğitimi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TUNÇ AKKOÇ
- Borate modified bioglass containing scaffolds for dental tissue engineering applications
Diş doku mühendisliği uygulamaları için borat ile modifiye edilmiş biocam içeren taşıyıcılar
REZA MOONESI RAD
Doktora
İngilizce
2018
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞEN TEZCANER
PROF. DR. ZAFER EVİS
- Pulpal dental kök hücre kaynağının kritik boyuttaki rat kalvaryal defekt modeli üzerindeki kemik rejenerasyon etkinliğinin incelenmesi
Bone regeneration efficacy of dental pulp stem cell source in rat calvarial critical size defect model
FATİH ASUTAY
Doktora
Türkçe
2014
Diş Hekimliğiİnönü ÜniversitesiAğız, Diş, Çene Hastalıkları ve Cerrahisi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SERKAN POLAT