Bag-1 overexpression leads to Bad phosphorylation at serine 136 revealing a route for survival in MCF-7 breast cancer cell line
Bag-1'in aşırı ifadesi Bad serin 136 fosforlanmasını sağlayarak MCF-7 meme kanseri hücre hattında sağkalımı işaret eder
- Tez No: 332910
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2012
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
Bcl-2 asosiye athano gen (Bag) ailesi (Yunanca ölüm karşıtı athanostan) proteinleri anti-apoptotik Bcl-2 proteini ile ko-immunopresipitasyon sonucu bulunmuşlardır.Belirlenmiş Bag proteinleri Bag-1 (RAP46/HAP46), Bag-2, Bag-3 (CAIR-1/Bis), Bag-4 (SODD), Bag-5 ve Bag-6 (BAT3/Scythe) olup hepsi C-terminus yakınında BAG domen (BD) ifadesine sahiptir. Bag proteinlerinin genellikle N terminuslarında farklılık göstermesi her bir Bag ailesi üyesinin çeşitli proteinler, yolaklar ve/veya lokalizasyonlara göre spesifite göstermesini sağlar. Hücrelerde Bag-1 izoformlarinin ekspresyon düzeyleri farklılık göstermektedir. Bu izoformlar hücrelerde bulunma sıklıklarına göre Bag-1S, Bag-1L ve Bag-1M olarak sıralanabilir. Buna rağmen tümörlü hücrelerde ekspresyon düzeyi en yüksek olan Bag-1L izoformudur. Bunun nedeni ise Bag-1L'nin nüklear lokalizasyonuna bağlı olarak transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini yönlendirmesi ve böylece hücre proliferasyonunu dolaylı yoldan tetiklemesi olabilir.Bu çalışmayla amaçlanan, MCF-7 meme kanseri hücre hattında Bag-1-ilişkili sağkalım mekanizmasının moleküler detaylarının aydınlatılmasıdır. Bu amaç doğrultusunda Bag-1'in ekspresyon seviyeleri değiştirilmiş ve hücreye etkisi incelenmiştir. Bag-1'in aşırı ekspesyonunu sağlama amacı ile TAP-tag içeren Bag-1'in ekspresyonunu arttıran plazmit; Bag-1'i susturmak için ise Bag-1'e özgü siRNA kullanılmıştır. Bag-1'in ekspesyonundaki değişikler western blotlama ile doğrulanmıştır. Bag-1'in aşırı ifadesinin hücre canlılığına yaptığı pozitif etkiler XTT hücre canlılığı ve tripan mavisi sağkalım deneyleri ile gösterilmiştir. Bag-1'in aşırı ifadesinin MCF-7 meme kanseri hücrelerinde sağkalımı arttırdığı gösterildikten sonra sağkalım yolağında görev yapan proteinlerin ekspresyonunun Bag-1 ekspresynundaki değişimlerle birlikte nasıl etkilendiği western blotlama ile araştırılmıştır. Western blot analizi sonuçları önemli MAP (mitogen-activated protein) kinazlar olan B-Raf ve C-Raf ekpresyonlarının Bag-1 aşırı ifadesi ile arrtığını göstermiştir. Ayrıca B-Raf'ın Serin 445, C-Raf'ın Serin 338 ve 289/296/301, Akt'nin Serin 473 bakiyelerinden fosfoslanma seviyelerinin ve Hsp70 expresyonunun da Bag-1 aşırı ekspesyonu ile arttığı, Bag-1'in susturulması ile azaldığı da western blotlama ile gözlemlenmiştir. Bag-1'ın hücre sağkalımını tetiklediği gösterildikten sonra Raf-Erk-MEK sinyal yolağının alt akışında bulunan proteinlerin de (Erk ve MEK) ekspresyonunu arttırdığı gösterilmiştir.Östrojen bağımlı meme kanseri hücrelerinde Bag-1'in bu sağkalım kompleksindeki etkileşim partnerlerini incelemek için ko-immünopresipitasyon yapılmıştır. Bag-1, fosforlanmış Akt, B-Raf, C-Raf, Bcl-2 ve Hsp70'in oluşturduğu bir kompleksin hücrede sağkalım mekanizmasını tetiklediği gösterilmiştir. Bag-1'in hücre içinde forforlanmış Akt, B-Raf, Bcl-2, Hsp70 ve C-Raf ile birlikte lokalize olduğu immüno hücre boyaması ile ispatlanmıştır. Daha önce sinir hücreleri (birincil hücre hattı) ile yapılan bir çalışmada Bag-1-ilişkili sağkalım kompleksine C-Raf'ın dahil olmadığı bulunmuştur.
Özet (Çeviri)
Bcl-2 associated athanogene family (athano = against death in Greek) proteins are discovered by co-immunoprecipitation with Bcl-2 anti-apoptotic protein. Bag genes are evolutionally conserved and their homologes exist in yeasts, plants and animals. Bag family members control the cell homeostais in two different ways: (1) They contribute to maintain cell?s vital activity under normal and stress conditions via regulating both positively and negatively the cycle of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone system. Bag-1 isoforms appear to be differently localized in the cells. Main Bag-1 isoforms which are observed in humans are Bag-1S (36 kDa), Bag-1M (46 kDa) and Bag-1L (50 kDa). There is also another isoform of Bag-1, 29 kDa, however, it is very scarce in the cell, and thus is not consistently detected. Cell survival and apoptosis are the two major pathways that Bag-1 is involved in. Bag-1 interactions with C-Raf or Bcl-2 are main mechanism that determine cell fate. Through these interactions Bag-1 gets invoved in the regulation the balance between cell death and cell survival. Although Bag-1 involvement in different mechanisms is known, the molecular details of these mechanisms and crosstalk between the pathways are not clear yet.In this study, we aimed to elucidate the molecular mechanism of Bag-1-associated cell survival in MCF-7 breast cancer cell line. To understand Bag-1?s influence on cell survival, we altered expression levels of Bag-1 in MCF-7 cells. TAP tagged-Bag-1 overexpressing plasmid was used for enhencement of Bag-1 level, and Bag-1 specific siRNA transfection was applied for down regulation of Bag-1. XTT cell proliferation assay and tryphan blue dye exclusion assay were performed to explain Bag-1?s effect on cellular level. Western blot analysis was used for checking expression levels of proteins that take part in cell survival and signaling pathways to investigate changes in the expression after Bag-1 overexpression or silencing. To deduce molecular details of Bag-1-related cell survival we checked interaction partners of Bag-1 during cell survival using co-immunoprecipitation. We also did immunocytochemistry to demonstrate subcellular co-localization of Bag-1 with its interaction partners from the cell survival complex. Our results showed that C-Raf is involved in the complex that is formed by B-Raf, Hsp70, phospho-Akt and Bcl-2 in order to phosphorylate Bad at serine 136 residue for the prevention of apoptosis.
Benzer Tezler
- Understanding the interplay between anti-apoptotic BAG-1 and AKT in mTORC1-mediated autophagy in breast cancer cell lines
mTORC1 aracılı otofajide anti-apoptotik BAG-1-AKT etkileşiminin meme kanseri hücre hatlarında araştırılması
ILGIN IŞILTAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Studying the role of an anti-apoptotic Bag-1 protein in healthy & tumor tissues in patients with breast carcinoma
Meme kanserli hastalardan alınan sağlıklı ve tümörlü dokularda anti-apoptotik Bag-1 proteinin rolünün çalışılması
EMİNE ARZU BAŞKALE
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Investigation of the autophagy and apoptosis relation through BAG-1, BcL-2 and Beclin 1
Otofajı̇ ve apoptoz ı̇lı̇şkı̇sı̇nı̇n BAG-1, BcL-2 ve Beclin 1 üzerı̇nden ı̇ncelenmesı̇
GİZEM ALKURT
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Oksidatif DNA hasarı sonucu aktifleşen onarım mekanizmalarının araştırılması
Investigating the repair mechanism activation by oxidative DNA damage
SELDA KARAMİL
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
BiyomühendislikEge ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. KEMAL SAMİ KORKMAZ
- Cilt fibroblast hücrelerinin UV kaynaklı hasarında protein oksidasyonu ve protein regülasyonunun rolünün incelenmesi
Protein oxidation and protein regulation in UV induced damage of skin fibroblast cells
BETÜL ÇATALGÖL
Doktora
Türkçe
2009
Biyokimyaİstanbul ÜniversitesiFarmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BUKET ALPERTUNGA