The role of Protein Kinase R in lipotoxicity
Protein Kinaz R'nin lipotoksisitedeki rolü
- Tez No: 336854
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. EBRU ERBAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Moleküler Tıp, Biotechnology, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: KPY, ER stresi, PKR, IRE1, Yağlar, UPR, ER stress, PKR, IRE1, Lipids
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 132
Özet
Protein ve yağ biosentezi, protein katlanması, kalsiyum salgılanması ve dengelenmesini de içeren sayısız fonksiyonuyla Endoplazmik Retikulum (ER) hücresel homeostaz için merkezi bir organeldir. Protein katlanması ya da salgılanmasıyla ilgili bir bozukluk olduğunda, ER zarlarından katlanmamış protein yanıtı (KPY) adı verilen özgün bir sinyal cevabı başlatır. KPY düzgün katlanmamış protein seviyesini azaltarak ER homeostazını eski haline getirmek için girişimde bulunur, fakat eğer ER homeostazı tekrar elde edilemezse ya da ER stresi uzun süreliyse KPY apoptoza yol açabilir. Üç özel ER zar proteini, inositol-gerektiren enzim-1 (IRE1), Protein Kinaz R?yi (PKR) anımsatan kinaz (PERK) ve aktifleştiren transkripsiyon faktör 6 bu yolakta stres sensörü olarak rol alır ve ER homeostazını tekrar sağlamak için ayrı fakat birbirinin içine geçmiş sinyal yolaklarını başlatır. Yakın zamanda, çalışmalar gösterdi ki aşırı beslenme, özellikle dolaşımda olan yüksek miktarda doymuş yağ asitleri ya da kolesterol, metabolik dokularda ER stresini indükler ve bu indüksiyon KPY sinyal yolaklarının aktifleşmesine yol açar. Ayrıca ER stresinin obezite, insülin direnci, tip 2 diyabet, ve aterosklerozis gibi metabolik hastalıklarının patogenezinde sebepsel bir rol oynadığı gösterilmiştir. Interferon ile indüklenebilen ve çift sarmallı RNA ile aktifleşen protein kinaz R?nin (PKR) de ER stresi sırasında aktifleştiği bilinmektedir.Son çalışmalar ayrıca PKR?nin ER stresi boyunca lipidler ile ve obez farenin metabolik dokularında aktifleşebileceğini göstermiştir. PKR?nin genetik ablasyon ya da inhibe edilmesi kemirgen modellerdeki obezitede insülin duyarlılığını ve sistemik glukoz homeostazını arttırır. Fakat PKR?nin aşırı beslenme ile ya da ER stresiyle nasıl aktifleştiği bilinmemektedir. Aslında yağ ile indüklenmiş hücresel streste ya da ölümdeki, birçok özel hücresel bileşen ve moleküler mekanizma, yani lipotoksisite tam olarak anlaşılamamıştır. PKR yağ ile indüklenen ER stresinde aktifleştiği bilinen serin/treonin kinazlarından biridir, fakat sadece birkaç özel substratı bilinmektedir ve bunlar PKR?nin kronik metabolik hastalık patogenezindeki lipotoksisitede PKR?nin rolünü açıklamada yetersiz kalmaktadır. PKR ayrıca inflamazom bileşenleriyle etkileşime girerek, inflamazom aktivasyonunda önemli bir rol alır. PKR?nin kronik metabolik hastalıklarda besin ile indüklenen iltihaplanma ve metabolizmadaki özel moleküler eylemlerine ilişkin bilgimizde bir boşluk bulunmaktadır. Bu tez çalışmasında, benim ana amacım PKR?nin aktivitesini düzenlemek için özel araçlar geliştirmek ve onun lipotoksisitedeki özel substratlarını ve yağ ile indüklenen ER stresi cevabında oynadığı rolü araştırmaktı. Bu amaçla, PKR?nin ER stresi sırasındaki kinaz aktivitesini özel olarak mofidiye etmek için özgün bir kimyasal-genetik yaklaşımı geliştirdim. Bu yaklaşımda, ATP analoglarının (engelleyen ya da aktifleştiren) PKR?nin ATP bağlanma boşluğuna uyum sağlayabilmesi için PKR?nin ATP bağlanma boşluğundaki iri hacimli yan-zincir bekçi aminoasit (metiyonin gibi) daha küçük yan-zincir aminoasitine (glisin gibi) değiştirilir. PKR?nin bu mutantı ATP analoğuna duyarlı kinaz (AZKA) olarak adlandırılır ve bu mutantın kinaz reaksiyonlarında normal ATP?nin yanında iri hacimli ATP analoglarından da yararlandığı gösterilmiştir. Buna ek olarak, ben PKR kinazının inhibe eden iri hacimli-Amino-1-tert-butyl-3-(1?-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (NaPP1) or 4-Amino-1-tert-butyl-3-(1?-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (1-NMPP1) gibi ATP analoglarıyla inhibe oluşunu gösterdim. Potansiyel PKR substratlarını tanımlamaya bir adım daha yaklaşmak için, ayrıca immünoçökeltilmiş PKR AZKA mutantı için kinaz reaksiyonlarını optimize ettim ve başlangıçtaki deneylerimde potansiyel aşağı sinyal yolaklarındaki substratlarını görüntüledim. Son olarak, yağ ile indüklenen ER stresi koşullarında, iki ER stresi ile ilgili kinasın arasındaki özgün ilişkiyi çalıştım. IRE1 kinazının kinaz değil ama endoribonükleaz aktivitesini bir inhibitör ile inhibe ettiğimde, yağlara bağlı PKR aktivasyonunun tamamen kaybolduğunu gözlemledim. Bu bulgular IRE1 kinazının RNAse aktivitesinin PKR kinazının yağ ile aktifleşmesi için gerekli olduğu bilgisini güçlü bir şekilde destekler. IRE1 kinazının RNAse bölgesinin bu fonksiyonu özgündür ve umulmadıktır. Bu araştırmanın gelecekteki hedefi IRE1-PKR bağlantısındaki RNA aracılarını keşfetmeye ve bu bunların kronik metabolik hastalıklarla ilşkili inflamatuar ve metabolik patolojilerdeki rolünü araştırmaya yönlendirilmelidir. Sonuç olarak, tez çalışmamda, PKR?nin kinaz aktivitesini özel olarak modifiye etmek ve bu şekilde özgün PKR substratlarını keşfetmek için özgün bir kimyasal-genetik yaklaşım geliştirdim. Bu tezde bulunan ön bulgulara göre, yağ ile indüklenen ER stresi esnasında PKR?nin birçok tanımlanmamış substratı var gibi görünmektedir. Buna ek olarak, kimyasal-genetik PKR?yi kimyasal genetik aracı olarak kullanarak ve başka diğer yaklaşımlarla, lipotoksisite esnasında IRE1 ve PKR kinazları arasında benzersiz, fonksiyonel bir ilişkinin varlığını gösterdim. Ayrıca, tezimdeki sonuçlar göstermekte ki; IRE1 kinazının endoribonükleaz aktivitesi PKR kinazının yağlar tarafından aktifleştirilmesi için gerekli ve yeterlidir. Çalışmalarım esnasında geliştirilen bu bulgular ve araçlarında, metabolik hastalıkların sağlıksal sonuçları için önemli olan PKR?nin lipotoksisitedeki özel rolünün analizi için daha fazla yararlanılabilir.
Özet (Çeviri)
Endoplasmic reticulum (ER) is a central organelle for cellular homeostasis through its myriad of functions including protein and lipid biosynthesis, protein folding and secretion and calcium homeostasis. When protein folding or secretion is disrupted, ER elicits a unique signaling response initiated at its membranes called the unfolded protein response (UPR). UPR attempts to restore cellular homeostasis and survival via reducing unfolded protein levels, however, if this cannot be achieved or the stress is prolonged the UPR could lead to apoptosis. Three specific ER membrane proteins, inositol-requiring enzyme-1 (IRE1), Protein Kinase R-resemble like ER kinase (PERK) and activating transcription factor 6 (ATF6), act as ER stress sensors and initiate distinct but interlaced signaling pathways to restore ER homeostasis. Recently, studies demonstrated that over nutrition, especially high amount of saturated fatty acids or cholesterol in the circulation, leads to the induction of ER stress in metabolic tissues, resulting in the activation of UPR signaling pathways. Furthermore, ER stress was shown to play a causal role in the pathogenesis of metabolic diseases such as obesity, insulin resistance, type 2 diabetes and atherosclerosis. Interferon inducible double strand RNA activated protein kinase R (PKR) is also known to be activated during ER stress. Recent studies showed it can be activated by lipids during ER stress in cells and in metabolic tissues of obese mice. Genetic ablation or inhbition of PKR enhances systemic glucose homeostasis and insulin sensitivity in obesity in rodent models. However, it is not known how PKR becomes activated by overnutrition or by ER stress. In fact, many of the specific cellular components and molecular mechanisms in lipid induced cellular stress or death, namely lipotoxicity, is not completely understood. PKR is one of the serine/threonine kinase that is known to be activated during lipid induced ER stress, but only a few specific downstream substrates are known and these fall short of explaining PKR?s role in lipotoxicity in chronic metabolic disease pathogenesis. PKR also plays a crucial role in activation of inflammasomes through interacting with the inflammasome components. There is a gap in our knowledge regarding PKR?s specific molecular actions in nutrient-induced inflammation and metabolism in chronic metabolic diseases. In this thesis study, my major goal was to develop specific tools to modulate PKR?s activity and search for its specific substrates in lipotoxicity and its role in mediating lipid-induced ER stress response. For this purpose, I developed a novel chemical-genetic approach to specifically modify PKR?s kinase activity during ER stress. In this approach, the bulky side-chain of a gatekeeper amino acid (such as methionine) in the ATP binding cavity of PKR has been altered to a smaller side-chain amino acid (such as glycine) in order to slightly enlarge the cavity to accommodate bulky ATP analogs (activating or inhibiting). This mutant of the PKR has been named the analog sensitive kinase allele (ASKA) of PKR and was shown to utilize normal ATP as well as the bulky ATP analogs in kinase reactions. Furthermore, I demonstrated the specific inhibition of PKR kinase with the inhibitory, bulky ATP analogs such as4-Amino-1-tert-butyl-3-(1?-naphthyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (NAPP1) or 4-Amino-1-tert-butyl-3-(1?-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine (1-NMPP1). In order to move one step closer to identification of potential PKR substrates, I also optimized kinase reactions for immunoprecipitated PKR ASKA mutant and visualized several potential downstream substrates in my initial experiments. Finally, I studied a unique relationship between two ER stress related kinases IRE1 and PKR in lipid induced ER stress conditions. I observed specific inhibition of IRE1?s endoribonuclease activity with an inhibitor, but not its kinase activity, completely blocks PKR activation by lipids. These findings strongly support hat IRE1?s RNAse activity is necessary for PKR kinase activation by lipids. This function of IRE1 RNAse domain is novel and unsuspected. The future goals of this research should be directed to discovering the RNA mediators of IRE1-PKR coupling and understanding their role in mediating the inflammatory and metabolic pathologies associated with chronic metabolic diseases. In conclusion, in my thesis study, I developed novel chemical-genetic approach to specifically modify PKR kinase activity that could be useful in discovering novel PKR substrates. Based on the preliminary findings in this thesis, PKR appears to have many unidentified substrates regulated during lipid induced ER stress. Furthermore, using the chemical-genetic PKR as a tool as well as several other approaches I demonstrated the existence of a unique, functional relationship between IRE1 and PKR in lipotoxicity. In addition, the results in my thesis shows that IRE1?s endoribonuclease activity is required and sufficient for PKR kinase activation by lipids. These findings and tools developed during my studies can be further utilized for analyzing the specific role of PKR in lipotoxicity, which is important for the health consequences of metabolic diseases.
Benzer Tezler
- Prevention of fatty acid-induced inflammasome activation by a bioactive lipokine
Serbest yağ asidlerinin neden olduğu inflammazom aktivasyonunun bir biyoaktif lipokin tarafından önlenmesi
SEDA KOYUNCU
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. EBRU ERBAY
- Agrobacterium tumefaciens enfeksiyonu ile ilişkili konak faktörlerin arpa (Hordeum vulgare L.) bitkilerinde araştırılması
Investigation of host factors associated with Agrobacterium tumefaciens infection in barley (Hordeum vulgare L.) plants
NADIA EL SARRAF
Doktora
Türkçe
2018
Genetikİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞE FİLİZ GÜREL
- The role of lipid induced integrated stress response in metaflammation and atherosclerosis
Entegre stres tepkisinin metaflamasyon ve atherosklerozdaki rolü
UMUT İNCİ ONAT
Doktora
İngilizce
2019
Moleküler Tıpİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ EBRU ERBAY
- D-alfa-Tokoferol'ün düz kas hücresi üzerine olan etkisinin in vivo olarak incelenmesi ve bunun aterosklerozdaki önemi
Başlık çevirisi yok
ÖNDER ŞİRİKÇİ
- Vascular function in chronic end-organ damage: pharmacological characterization of vasomotor function in systemic vasculature
Kronik uç-organ hasarında vasküler fonksiyon: Sistemik damarlarda vazomotor fonksiyonun farmakolojik karakterizasyonu
NADİR ULU
Doktora
İngilizce
2009
Eczacılık ve FarmakolojiUniversity of Groningen (Rijksuniversiteit Groningen)Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ROBERT HENK HENNING