Geri Dön

İnsan adipoz dokusu ve adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere kriyoprezervasyonunun optimizasyonu

Ortimization of cryopreservation protocols for adipose tissue and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and their potential use in tissue engineering

PDF İndir

  1. Tez No: 378421
  2. Yazar: NECATİ FINDIKLI
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ADIL ALLAHVERDIYEV
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2014
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 154

Özet

Amerikan Plastik Cerrahi Derneği verilerine göre, Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) 2012 yılı içerisinde yaklaşık 300.000 civarında yumuşak doku defekti tamiri amacı ile mastektomi sonrası meme, el ve yüz gençleştirme işlemlerini de kapsayan cerrahi işlem gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın her yıl giderek arttığı bilinmektedir. Ülkemizde ise bu alanda çalışmalar yapılsa da rakamsal bir bilgi bulunmamaktadır. Son yıllarda yumuşak doku mühendisliği ve klinik doku tamiri uygulamalarında kök/progenitör hücrelerin kullanılması ve bu yolla elde edilmiş yapay dokuların oluşturulması gibi yeni yaklaşımlar ve çalışmalar, yer almaktadır. Bu bağlamda lipoaspirasyon metodu ile elde edilebilen otolog adipoz doku, içerdiği zengin kök/progenitör hücre popülasyonu sayesinde adı geçen yumuşak doku defektlerinin giderilmesinde ve iyileştirilmesinde yüksek potansiyele sahiptir. Dünya genelinde yılda milyonlarca lipoaspirasyon ve kozmetik amaçlı adipoz doku rezeksiyonu uygulaması yapılmaktadır. Bu uygulamalardan elde edilen adipoz dokuların etkin ve verimli olarak yakın gelecekte yumuşak doku travmaları dışında pek çok farklı doku mühendisliği veya rekonstrüktif cerrahi uygulaması için doğal otolog doku kaynağı olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen adipoz dokunun veya içerdiği progenitör hücrelerin daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezervasiyonunun yapılması, kriyopbankta uzun sure saklanması ve gerektiğinde biyolojik özelliklerini kaybetmeden kriyobanktan çıkarılarak çözülmesi, ve alıcının ihtiyaç duyulan bölgesine nakli sonrasında iyi sonuçların elde edilmesi oldukça önemli olup, yumuşak doku mühendisliği ve plastik/rekonstrüktif cerrahinin esas hedeflerinden biridir. Ancak kriyobiyolojinin bu alanında hücre ve dokuların dondurulma/çözülmeleri sonrası klinik kullanımlarıyla ilgili varolan ciddi problemler (insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, çözme sonrası düşük viabilite, nakledilen bölgede yüksek re-absorbsiyon vb.) halen giderilememiştir. Şimdiye kadar dünyada bu alanda çeşitli çalışmalar yapılsa da halen verimli bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon yöntemi geliştirilememiştir. Bunun nedenlerinden biri, şimdiye kadar uygun kriyoprotektanların, kriyoprotektan konsantrasyonlarının, karışımlarının, vitrifikasiyon gibi önemli kriyoprezervasiyon yönteminin adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerde yeterince incelenmemiş olmasıdır. Ayrıca mevcut yaklaşımların doku yenileme ve uygulanan bölgede mevcut hasarın tamirindeki etkinliği konusunda bugüne kadar gerçekleştirilen az sayıda klinik-öncesi ve klinik çalışmada, kök hücre ve içinde bulunduğu niş özellikleri dikkate alınmadığından çalışmalar her zaman olumlu sonuçlar vermemektedir. Mevcut bilgilere dayanarak bu tez çalışmasının amacı, yumuşak doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, mevcut konvansiyonel yöntemler ile kriyoprezervasyonundaki yapısal ve fonksiyonel düzeydeki etkinliklerinin belirlenmesi, adipoz doku ve içerdiği kök hücrelerin kriyoprezervasyonu ile ilgili mevcut problemlerin giderilmesinde vitrifikasyon metodu ile kriyoprezervasyon rejimlerinin ve yaklaşımlarının etkinliğinin incelenmesi, elde edilen verilere dayanarak insan adipoz doku/adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon protokollerinin optimize edilmesi ile klinik kullanıma uygun doku ve hücre saklama amaçlı kriyobank oluşturulmasıdır. Belirlenen amaç doğrultusunda çalışma genelinde 10 farklı donörden lipoaspirasyon (n=8) ve cerrahi eksizyon (n=2) uygulamaları sonrası elde edilen adipoz doku örnekleri kullanıldı. Örneklerin 6'sına adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücre izolasyonu amacı ile enzimatik ayrıştırma tekniği uygulandı. Hücre izolasyonu aşamasında ayrıca manyetik tabanlı hücre ayrıştırılması tekniği de kullanıldı. İzole edilen hücrelerin kök hücre olma özellikleri in vitro kültürdeki morfolojik analiz, akış sitometrisi (CD90, CD105, CD29, CD34, CD45) ve in vitro ekspansiyon/farklılaşma testleri kullanılarak ölçüldü. Doku ve hücre kriyoprezervasyonu için, içerisinde kriyoprotektan olarak DMSO, etilen glikol ve sükroz'un farklı konsantrasyonları veya kokteylleri bulunan aşamalı yavaş dondurma (%10 DMSO; %10DMSO+0,2M sükroz; 0,5M sükroz) ve vitrifikasyon teknikleri (%15 DMSO+%15 etilen glikol+0,5M sükroz; %30DMSO+%30 etilen glikol+0,5M sükroz) kullanıldı. Kriyoprezervasyon sonrası dokuların yapısal durumları immünohistokimya tekniği ile, hücrelerin yapısal ve fonksiyonel durumları ise Tripan mavisi boya dışlama testi, TUNEL testi ile DNA fragmantasyon analizi ve in vitro farklılaşma analizi kullanılarak ölçüldü. Çözme sonrası doğrudan dondurulan veya dondurulmuş dokudan izole edilen hücreler ayrıca morfolojik ve in vitro ekspansiyon özellikleri bakımından incelendi. İncelemeler ve ölçümler sırasında elde edilen kantitatif veriler SPSS versiyon 10.0 for windows programı ile değerlendirildi ve değerlendirme sırasında p0,05). Çalışmanın üçüncü aşamasında, deney kapsamında elde edilen insan adipoz dokuları (n=4) ve adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücreleri (n=4), mevcut konvansiyonel ve vitrifikasyon protokolleri kullanılarak doku ve hücre dondurma programlarına alındı. Her iki grup, ayrı ayrı olarak iki farklı metod (aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon), farklı inkübasyon süreleri ve kriyoprezervasyon sonrası farklı saklama sıcaklıkları yönünden test edildi. Hücre düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında, aşamalı yavaş dondurma gerçekleştirilen %10 DMSO ve %10DMSO+0,2M sükroz grubu ile, vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %80,2, %88,9, %85,4, %68,2 ve %12,2; p

Özet (Çeviri)

According to American Society of Plastic Surgeons, in 2012, approximately 300.000 procedures have been performed for soft tissue repairs including breast and nipple reconstruction (after mastectomy), hand and face rejuvenation and this number continues to increase annualy. In Turkey, although the application of these procedures have usually been performed in many clinics, such information is not available for the public yet. Contemporary research in soft tissue engineering indicates that, numerous soft tissue defects can be efficiently repaired when appropriate biomaterials, cells and growth factors can be delivered together to the wounded location. For this reason, novel approaches and works are currently directed to the creation of artificial tissues by integrating stem/progenitor cells in natural scaffolds. Adipose tissue, which can be obtained after lipoaspiration, has a high poteintial in repairing and healing of soft tissue defects via its rich content of adipose mesenchymal stem cell (AD-MSC)/progenitor cell populations. Every year, milions of lipoaspirations and adipose tissue resections for cosmetic purposes are performed worldwide. Effective cryopreservation of these tissues can be very important natural autologus tissue sources for tissue engineering aplications other than soft tissue defects or reconstructive surgery applications. Successful cryopreservation of adipose tissue, which is mostly obtained during lipoaspiration procedures with the aim of using in the near future, and effective warming and transplanting it into the defective site when needed has often been applied in soft tissue engieering and plastic/reconstructive surgery. Although cryopreservation of fat tissue have long been a preferred approach in several clinics undergoing liposuction procedures, problems associated with their clinical use after warming (low cellular viability upon warming, high reabsorbtion rates on recipient sites etc.) have not been fully resolved. There is still a lack of successful and efficient adipose tissue/AD-MSC cryopreservation protocol in the world. Moreover, the number of studies on the ability and effectiveness of cryopreserved adipose tissue or AD-MSCs in repairing a defect in the required site are scarce and the results are conflicting. Based on current knowledge, our aim in this study is, to analyze the structural and functional integrity of human adipose tissues and adipose tissue-derived mesechymal stem cells during conventional cryopreservation procedures, to investigate the potential role of vitrification regimes and approaches in solving current problems associated with adipose tissue/ stem cell cryopreservation, and by optimizing the human adipose tissue and adipose tissue-derived mesenchymal stem cell cryopreservation protocols, to establish a tissue and cell cryobank that is suitable or compatible for clinical use. In accordance with the objectives set our study, 10 different tissue samples that were obtained from different donors after lipoaspiration (n=8) and surgical excision (n=2) were used in the study. In 6 of these samples, enzymatic dissociation method was used in order to isolate mesenchymal stem cells. At this stage, magnetic-based cell separation technique was also applied. Stem cell properties of these freshly isolated cells were measured by in vitro culture and morphological analysis, flow cytometry (CD90, CD105, CD29, CD34, CD45) and in vitro expansion/differentation tests. For tissue and cell cyryopreservation, staged slow freezing (10% DMSO; 10% DMSO+0.2M sucrose; 0.5M sucrose) and vitrfication (15% DMSO+15% Ethylene glycol+0.5M sucrose; 30% DMSO+30% ehylene glycol+0.5M sucrose) techniques that consists of DMSO, ehylene glycol (EG) and sucrose in different concentrations and coctails were used. Upon warming, tissue integrity was measured by immunohistochemistry and structural and functional integrity of cells were measured by trypan blue dye exclusion test, TUNEL test for DNA fragmentation and in vitro differentiation. Cryopreserved cells and cells that were isolated upon warming of tissues were also investigated according to their in vitro morphologies and in vitro expansion characteristics. Quantitative data obtained during these investigations were evaluated by SPSS 10.0 for windows software programme and the p value of

Benzer Tezler

  1. Tez No

    596904

    Sığır spinal meninks'in hücrelerinden arındırılması ve rejeneratif biyomalzeme olarak etkinliğinin değerlendirilmesi

    Decellularization of bovine spinal meninges and evaluating theirefficacy as a regenerative biomaterial

    EREN ÖZÜDOĞRU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyomühendislikÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Biyomühendislik ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ YAVUZ EMRE ARSLAN

  2. Tez No

    375145

    Adipoz kökenli kök hücre ile yapay kıkırdak gelişiminin incelenmesi

    Examination of the development of artificial cartilage with adipose derived stem cells

    SERKAN BARIŞKAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    Kulak Burun ve BoğazCelal Bayar Üniversitesi

    Kulak Burun Boğaz Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. KIVANÇ GÜNHAN

  3. Tez No

    443935

    Hipoksik ve normoksik ortam şartlarında osteojenik nesile farklılaştırılmış insan adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin gen/mikrorna ifade profillerinin karşılaştırmalı analizi

    Comparative evaluation of the gene/microrna expression profiles of hypoxic and normoxic conditions on the osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells

    OYA ÇELİKAĞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyolojiAnkara Üniversitesi

    Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE ESER ELÇİN

  4. Tez No

    616770

    İnsan yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücreleri ile yüklenmiş hyaluronik asit/jelatin plazma jellerin yumuşak doku mühendisliği uygulamalarında kullanımı

    Soft tissue engineering applications of human lipoaspirate-derived stem cells on hyaluronic acid/gelatin plasma gels

    ESRA KORURER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    BiyomühendislikKocaeli Üniversitesi

    Kök Hücre Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ERDAL KARAÖZ

  5. Tez No

    493417

    Adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücre kültürlerinde hücre yüzey markırlarının immunositokimyasal değerlendirmesi

    Immunocytochemical evaluation of cell surface markers in adipose tissue-derived mesenchymal stem cell cultures

    GÜLSEMİN ÇİÇEK

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Histoloji ve EmbriyolojiNecmettin Erbakan Üniversitesi

    Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SELÇUK DUMAN

Geri Dön