Geri Dön

Investigations on the n-linked glycosylation of the Aspergillus niger lipase in pichia pastoris

Aspergillus niger lipaz'in Pichia pastoris'deki n-bağlı glikozilasyon ile ilgili araştırma

PDF İndir

  1. Tez No: 392232
  2. Yazar: SERKAN SIRLI
  3. Danışmanlar: PROF. OSMAN UĞUR SEZERMAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Mühendislik Bilimleri, Bioengineering, Biotechnology, Engineering Sciences
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2014
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Sabancı Üniversitesi
  10. Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 63

Özet

Aspergillus niger lipazı doğal olarak 35-40 kDa moleküler ağırlığında olan 1,3 özlü ekstraselüler bir enzimdir. ANL'nin sıcaklığa karşı optimum aktivitesi 30oC-50oC aralığında ve ANL'nin pH'a karşı optimum aktivitesi 5.0-6.0'dır. Asıl Aspergillus niger lipazı şeker içermektedir; bu sebepten dolayı bizim buradaki amaçımız N-bağlı glikozilasyonın Pichia pastoris'deki etkilerini belirlemektir. Bu araştırma içerisinde tekli ve çiftli asparajinin mutasyonuna (ANL1, ANL2 ve ANL3) bağlı olarak değişiklik gösteren ANL'ler üretilmiştir. Bu asparajin lokasyonları NetNGlyc 1.0 sunucusu ve GlycoEP sunucusu aracılığıyla elde edilmiştir. ANL ile birlikte üç mutant ANL'nin ikisi (ANL2, ANL1-2), protein mühendisliği rutin yöntemlerinden olan yönlendirilmiş mutagenez, ligasyondan bağımsız klonlama, heterolog protein ekspresyonu, afinite purifikasyonu kullanılarak yüksek saflıkta elde edilmiştir. Glikozilasyon desenlerinin karakterizasyonu için, asıl ve mutant ANL'ler EndoHf ile işlenmiş olup analizleri SDS-PAGE ile yapılmıştır. Ayrıca asıl ve mutant ANL'lerin termostabilitesi denemeleri yapılmıştır. Sonuçlara göre mutasyona uğrayan ANL'lerin glikozilasyon desenleri asıl ANL'den farklılık göstermektedir. SDS-PAGE analizlerine göre, asıl ANL bulanık bir görüntüyle 35-40 kDa arasında görünmekte olup, N150Q mutasyonuna sahip olan ANL bulanık bir görüntüyle 30-35 kDa arasında görünmektedir. Diğer mutasyona sahip ANL örnekleri asıl ANL'den farklılık göstermemektedir. Bu sonuç 150. aminoacidin ANL'nin glikozilasyonunu değiştirerek etki ettiğini göstermektedir. EndoHf işleminden sonra, bulanık olan görüntü kaybolmakta ve bütün proteinler tek bir şerit halinde 35 kDa olarak gözlenmiştir. Termostabilite sonuçlarına göre asıl ANL'de dahil olmak üzere tüm lipazlar maksimum aktiviteye 30-45oC arasında sahiptir. Bu durumda mutasyonların 50 dereceye kadar termostabiliteye bir etkisi olmadığı görülmektedir. P. pastoris'deki ANL'nin içerisindeki N-bağlı glikozilasyon yerinin (N150Q) glikozilasyona etkisi büyük olup, diğer iki mutasyonun glikozilasyon mekanizmasında önemi yoktur. Son olarak, bu çalışma translasyon sonrası modifikasyonları içeren dolayısıyla stabilite değişimini sağlayacak mutasyonların üretimini kapsamaktadır. Böylelikle bu çalışma, optimal özellikteki enzimlerin tasarımını hedefleyerek, enzimoloji dalındaki uygulamalara katkı sağlayacaktır.

Özet (Çeviri)

Aspergillus niger lipase naturally exists as an extracellular 1,3-specific lipase with molecular weight of 35-40 kDa. The optimal temperature for ANL activity lies between 30°C-50°C, while the optimal pH is between 5.0-6.0. As the native Aspergillus niger lipase contains sugar modified residues, here the aim is to determine the impacts of N-linked glycosylation of ANL in Pichia pastoris. ANL variants generated in this study are single or double combination of asparagine mutations which as N59Q, N150Q, N269Q are referred to ANL1, ANL2 and ANL3 respectively. These asparagine sites were predicted using glycolsylation servers NetNGlyc and GlycoEP. Native ANL, as well as two other mutants (ANL2, ANL1-2) out of three mutants (ANL1, ANL2 and ANL3) are obtained in high purity through routine molecular biology and protein engineering tools including site-directed mutagenesis, ligation-independent cloning, heterologous protein expression and affinity purification methods. For characterization of glycosylation patterns, native and mutant ANL were treated with EndoHf and analyzed with SDS-PAGE. The native ANL and the mutants were also used in lipase assays to determine thermostability. The results indicated that the mutations possess differential glycosylation patterns than those of the native lipase. According to the SDS-PAGE analysis, native ANL was observed at 35-40 kDa with a smear appearance, while the mutants that contain N150Q were between 30-35 kDa and the other mutants did not change the native features. This result indicates that mutation in the 150th aminoacid has significant effect to alter the glycosylation of ANL. After EndoHf treatment, the smear appearances of the native the mutants disappeared, and all of the proteins were observed as single band at 35 kDa. The thermostability results showed that all of the lipases including the native ANL had the maximal activity at 30-45°C, indicating that the mutations did not have any effect on thermostability of the native ANL until 50oC. N-linked glycosylation site (N150Q) in ANL had a major impact in glycosylation of ANL in P. pastoris, while the other two mutations (N59Q, N269Q) were not included in glycosylation mechanism. Finally, the scope of this thesis could be used to generate mutations with altered post-translational modifications and thus altered stability. As a result, the findings of this thesis would impose implications in enzymology which aims to design enzymes with optimal features.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    687846

    Investigation of the glycosidase activity and recombinant production of different Bacteroides species

    Farklı Bacteroides türlerinin glikosidaz aktivitelerinin incelenmesi ve rekombinant olarak üretimi

    AYŞE BAYRAKTAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Biyomoleküler Bilimler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERCAN KARAV

  2. Tez No

    841531

    Deneysel meme tümörü modeline bağlı gelişen karaciğer metastazında gliko-gen ifadelerinin ve glikoprotein yapılarının belirlenmesi ve biyobelirteç potansiyellerinin araştırılması

    Determination of glyco-gene expressions and glycoprotein structures in liver metastasis due to experimental breast tumor model and investigation of biomarker potential

    NEBİYE PELİN TÜRKER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyoteknolojiTrakya Üniversitesi

    Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ELVAN BAKAR

  3. Tez No

    75041

    Theoretical and experimental investigations on the phasetransitions of polymeric systems

    Polimerik sistemlerin faz geçişlerinin teorik ve deneysel olarak incelenmesi

    NİLHAN KAYAMAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    1998

    Kimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NURSELİ UYANIK

  4. Tez No

    467158

    Swelling and elasticity of smart ionic gels based on N,N-dimethylacrylamide with acidic comonomers

    N,N-dimetilakrilamit ile asidik komonomer esaslı akıllı iyonik jellerin şişme ve elastisitesi

    TALİN BOYACI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Kimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NERMİN ORAKDÖĞEN

  5. Tez No

    75415

    Anyonik reaktiflerin sepiyolit tarafından adsorplanma mekanizması

    Başlık çevirisi yok

    MUSTAFA ÇINAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1998

    Maden Mühendisliği ve Madencilikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Maden Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET SABRİ ÇELİK

Geri Dön